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000787141 246_3 $$aModellbasierte experimentelle Analyse von enzymkatalysierten Reaktionsnetzwerken$$yGerman
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000787141 5203_ $$aDie kinetische Beschreibung von enzymkatalysierten Reaktionen ist eine zentrale Aufgabe in der Biotechnologie und Bioverfahrenstechnik. Insbesondere mechanistische Modelle unterstützen bei der Anwendung neu entdeckter Biokatalysatoren. Diese Arbeit zielt darauf ab, die kinetische Identifikation von enzymkatalysierten Reaktionsnetzwerken im Allgemeinen und das kinetische Verständnis von ThDP-abhängigen Enzymen im Speziellen voranzutreiben. Letztere katalysieren vielseitige Reaktionen mit hoher Enantioselektivität, jedoch ist ihr kinetisches Verständnis noch unzureichend. Die Entwicklung kinetischer Modelle umfasst die Herleitung von Modellgleichungen, Versuchsdurchführung, Parameterschätzung und Modellanalyse. Dabei erlauben optimal geplante (OED) Verlaufskurvenexperimente eine effiziente Bestimmung von Enzymkinetiken. Es ist jedoch nur schwer nachvollziehbar, warum bestimmte Versuche für die nichtlinearen enzymkinetischen Modelle vorgeschlagen werden. Um dieses Verständnis von OEDs zu verbessern, wurden verschiedene Optimalitätskriterien systematisch mit Hilfe von Oberflächen- und Konturdiagrammen untersucht. Die Visualisierung erlaubte das Ableiten von Heuristiken für die Identifikation von Enzymkinetiken. Die entwickelten OED-Routinen wurden im Anschluss für die kinetische Analyse der Selbstligation von Benzaldehyd zu (R)-Benzoin angewendet. Die Selbstligation wird durch die Benzaldehydlyase aus dem Pseudomonas Flourescens (PfBAL) katalysiert, wobei jedoch das Substrat die PfBAL inaktiviert. Da bisher nur wenige mechanistische Modelle für die Beschreibung von Karboligationen bei gleichzeitiger Inaktivierung des Biokatalysators zur Verfügung stehen, wurde die Reaktionskinetik und Inaktivierung gleichzeitig aus Verlaufskurvenexperimenten bestimmt. Ein OED steigerte die Parametergenauigkeit und hielt die notwendige Versuchsanzahl moderat. Diese Ergebnisse und zuvor veröffentlichte Versuche für das Substrat 3,5-Dimethoxybenzaldehyd dienten dazu, den Einfluss verschiedener Modellgleichungen bzw. von Modellen mit und ohne Enzyminaktivierung auf die Parameterwerte zu untersuchen. Die Analyse zeigt Strickfallen bei der Interpretation von enzymkinetischen Parametern auf und schlägt eine Strategie für das Datenmanagement und die Validierung von kinetischen Modellen vor. ThDP-abhängige Enzyme katalysieren zudem verzweigte Reaktionsnetzwerke, die beginnend von einem zentralen Intermediat über alternative Reaktionspfade in zwei unterschiedlichen Produkten enden. Die weitverbreitete Cleland-Notation für lineare Reaktionen wurde für solche Reaktionssysteme erweitert und erstmalig explizite Reaktionsgleichungen für zwei gekoppelte geordnete Bi Uni Reaktionen abgeleitet. Die Entwicklung von Modellgleichungen für verzweigte Reaktionsnetzwerke wurde mit automatisierten Routinen zusätzlich vereinfacht. Mit den neuen Modellgleichungen konnte eine modellbasierte experimentelle Analyse für die PfBAL katalysierte Kreuzkarboligation von Benzaldehyd und Propanal zu (R)-2-Hydroxy-1-phenylbutan-1-on durchgeführt werden. Diese Reaktion kann mechanistisch modelliert werden und führt zu sinnvollen kinetischen Parametern.$$lger
000787141 520__ $$aThe kinetic description of enzyme-catalyzed reactions is a core task in biotechnology and biochemical engineering. In particular, mechanistic models help from the discovery of the biocatalyst throughout its application. This thesis aims at advancing both the kinetic identification procedure for enzyme reaction networks in general and the kinetic understanding of Thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes in particular. The latter are viable biocatalysts which catalyze a broad range of reactions with excellent enantioselectivity, but their kinetic understanding still falls behind. The development of kinetic models comprises deriving rate equations, performing experiments, estimating parameters, and analyzing the model. Progress curve experiments combined with optimal experimental designs (OED) are an efficient approach to determine enzyme kinetics. As it is hardly possible to verify why specific experiments are suggested for nonlinear enzyme kinetic models, surface and contour plots of different OED criteria were systematically investigated. The analysis improved the understanding of OED and allowed deducing five suggestions for kinetic identification. The developed OED-routines were then applied during the kinetic identification of the benzaldehyde self-carboligation yielding (R)-benzoin catalyzed by benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens (Pf BAL). Moreover, benzaldehyde inactivates Pf BAL. Because only few mechanistic models for carboligation and simultaneous inactivation are available today, the reaction kinetics and inactivation of the biocatalyst were simultaneously determined from progress curves. OEDs improved parameter precision significantly while maintaining the necessary number of 13 experiments moderate. These results and previously published experiments on Pf BAL-catalyzed self-ligation for the substrate 3,5-dimethoxybenzaldehyde were then used to investigate both the effect of using different kinetic model equations and the effect of using models with and without enzyme inactivation on the kinetic parameter values. The analysis highlighted possible pitfalls in the interpretation of kinetic parameter estimates and suggests a consistent strategy for data management and validation of kinetic models. Furthermore, ThDP-dependent enzymes catalyze branched reaction networks which undergo two alternative pathways for the release of two different products from a central intermediate. The commonly used Cleland’s notation for linear reactions was extended for branched reaction pathways, and the rate expressions for two coupled ordered bi uni reactions were explicitly derived for the first time. This derivation demonstrated that numerous mathematical operations need to be performed. Therefore, an automated routine was developed to derive micro- and macrokinetic rate expressions for complex reaction networks with up to eight different products. The new rate expressions for branched reaction networks allowed to perform model-based experimental analysisfor the cross-ligation of benzaldehyde and propanal catalyzed by PfBAL yielding (R)-2-hydroxy-1-phenylbutan-1-o ne and to show that such a reaction mechanism can be modeled mechanistically while leading to reasonable kinetic parameters.$$leng
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