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000788170 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2020
000788170 502__ $$aDissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2019, Kumulative Dissertation$$bDissertation$$cRheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen$$d2019$$gFak10$$o2019-12-17
000788170 5203_ $$aKrebs ist mit einer Mortalitätsrate von 21% eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Die Hauptursache der hohen Morbidität und Mortalität ist die Bildung von Metastasen, die für etwa 90% aller krebsbedingten Todesfälle verantwortlich sind. Die der Metastasenbildung zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind Gegenstand aktueller Forschungsansätze. Es konnte bereits belegt werden, dass Metastasen durch einer Serie pathologischer Änderungen entstehen. Ausgehend von einem lokal begrenzten Primärtumor, gelangen Tumorzellen über das Lymph- bzw. Blutgefäßsystem in entfernte Organe und Gewebe, wo sie sich ansiedeln und eine sekundäre Tumorbildung auslösen. Durch das Auslösen einer lokalen Entzündungsreaktion am Ort der Tumorbesiedlung wird eine pro-tumorgene Mikro-Umgebung geschaffen, die die Ausbreitung der Metastasen begünstigt. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Krebsforschung und Arzneimittelentwicklung sind die Chancen auf ein Langzeitüberleben bei Krebspatienten immer noch sehr limitiert, insbesondere im Falle von fortgeschrittenen Tumorstadien. Um die Früherkennung von Krebs zu verbessern, wurden mehrere Serumproteine als Tumormarker durch die Food and Drug Administration (FDA) zugelassen. Dabei handelt es sich unter anderem um die Tumormarker Cancer-Antigen 125 (CA-125), Carbohydrate-Antigen 19-9 (CA19-9), Karkinoembryonales Antigen (CEA) und Prostata-spezifisches Antigen (PSA), die in der klinischen Praxis zur Diagnose von Tumoren eingesetzt werden. Ihr Nutzen ist jedoch auf bestimmte Tumorarten beschränkt. Zudem werden sie aufgrund einer geringen Sensitivität und Spezifität zumeist nur im Verlaufsmonitoring und nicht in der Krebsfrüherkennung eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob im Verlauf einer Metastasierung systemische Veränderungen auftreten, die hinweisend für eine Tumorausbreitung im Körper oder einer damit einhergehenden tumorassoziierten Entzündungsreaktion sind. Derartige Veränderungen könnten sich auf die Zusammensetzung des Urins an Peptidfragmenten auswirken, da diese die terminalen Abbauprodukte spezifischer Blut- und Gewebeproteine darstellen. Werden tumorspezifische Peptide identifiziert, könnten diese in einem nicht-invasiven diagnostischen Test zur Verlaufskontrolle des Wachstums und Metastasierung von Tumoren eingesetzt verwendet. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in einer klinischen Studie die individuellen Peptidprofile von mehr als 2.000 humanen Urinproben mittels Kapillarelektrophorese-gekoppelter Massenspektrometrie (CE-MS) analysiert. Zur Identifizierung tumorassoziierter Peptide im Urin wurden Patienten mit Blasen-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, sowie Nierenzell- und Gallengangskarzinom mit gesunden Probanden und Patienten mit gutartigen Erkrankungen der entsprechenden Organe, unter anderem chronische Pankreatitis, benigne Prostatahyperblasie, entzündlichen Gallengangsverenungen in einer statistischen Datenanalyse verglichen. Hierbei wurden 193 Peptide identifiziert, die durch Kombination zu einem diagnostischen Muster in einem unabhängigen Patientenkollektiv mit 69 % Sensitivität und 80% Spezifität eine hohe Testgenauigkeit in der Erkennung von Tumoren erzielten. Das auf diese Weise entwickelte Peptidmarkermuster hat somit das Potenzial, die Ausbreitung von Tumoren im Urin des Patienten zu erkennen, und könnte zukünftig als nicht-invasiver Screening-Test zur Verlaufsbeobachtung des Tumorwachstums und zur Überwachung einer antitumoralen Therapie eingesetzt werden. Ein weiterer Ansatzpunkt zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zur Tumordiagnostik sind tumorbedingte Änderungen in der posttranslationalen Modifikation bestimmter Proteine. Daher war das zweite Ziel der vorliegenden Arbeit die Klärung der Frage, ob es Unterschiede in der Zusammensetzung von Kohlenhydratseitenketten zwischen Glykopeptiden im Urin von Krebspatienten und denen von gesunden Individuen gibt. In diesem Zusammenhang wurde der Fokus auf die O- und N-Glykosylierung von Peptiden gelegt. Die Annahme, dass solche Unterschiede in der Glykosylierung von Peptiden im Urin für die Entwicklung neuer Krebsbiomarker herangezogen werden können liegt in der Tatsache begründet, dass die meisten von der FDA zugelassenen Krebsbiomarker Glykane oder Glykoproteine sind. Prominente Beispiele hierfür sind CA19-9, CA125, PSA und CEA. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Methode entwickelt, die mit Hilfe einer massenspektrometrischen Analyse (CE-MS und/oder Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)) eine direkte Untersuchung N- bzw. O-glykosidischer Peptide (die häufigsten Typen der Glykosylierung) ohne vorherige Auftrennungs- und Anreicherungsschritte ermöglicht. Mit dieser neuen Methode war es möglich, den Glykosylierungszustand während der Probenanalyse zu erhalten und für eine Korrelation mit dem Tumorstatus zu verwenden. Es wurde dadurch möglich, in den Urinproben von Krebspatienten und gesunden Menschen spezifische O- und N-glykosylierte Peptide nachzuweisen und zu charakterisieren. Der Vergleich massenspektrometrischer Peptidprofile offenbarte Unterschiede in der Verteilung dieser Glykopeptide zwischen Patienten mit Blasen-, Prostata-, Pankreas-, Gallengangs- oder Nierenzellkarzinom gesunder Probanden. Somit bietet die Etablierung dieser massenspektrometrischen Methode zur Detektion von Glykopeptiden im Urin die Möglichkeit, das Glykoproteom hinsichtlich krankheitsspezifischer Einflüsse in Zukunft genauer zu untersuchen.$$lger
000788170 520__ $$aCancer is one of the main causes of death worldwide, contributing to 21% of the overall mortality rate. The major cause of cancer morbidity and mortality is cancer metastasis, accounting for approximately 90% of all cancer related deaths. As the molecular mechanisms triggering metastasis are still under investigation, it has been shown that cancer metastasis occurs through a series of pathological changes, starting from local invasion, followed by tumor cell intravasation towards lymphatic and blood vessels, respectively, and subsequent extravasation to distant organs and/or tissues leading to secondary tumor formation. In addition, this complex process of human tumor pathogenesis triggers an intrinsic inflammatory response building a pro-tumorigenic microenvironment. Despite the recent advancements in cancer research and drug development, the long-term survival of most patients suffering from cancer still remains poor, especially in more advanced stages. In order to increase the chances of detecting cancer earlier, several biomarkers have been approved by the Food and Drug Administration (FDA) to be introduced in clinical practice such as cancer antigen 125 (CA-125), carbohydrate antigen 19-9 (CA19-9), carcinoembryonic antigen (CEA) and prostate specific antigen (PSA). Nevertheless, the clinical utility of those markers is limited due to suboptimal sensitivities and specificities especially for early cancer detection. Moreover, most of these biomarkers have been identified in the context of a specific type of cancer. In order to identify and characterize the mechanisms underlying metastasis processes in a more systemic way, the present thesis focus on the hypothesis that cancer progression is associated with common molecular changes, possibly reflecting tumor invasion and inflammation. These changes could be reflected in urine composition, the combination of such urinary peptides into a multi-marker pattern, may serve as a non-invasive test to monitor cancer progression and metastasis. For the purpose of this study, more than 2,000 of urinary peptide datasets were investigated, derived from capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-MS) from five different types of solid tumors (bladder, prostate and pancreatic cancers, renal cell carcinoma and cholangiocarcinoma) aiming at the identification of cancer-related markers in urine. This resulted in the identification of a 193 urinary peptides combined into a multi-marker pattern generated using a support vector machine (SVM) algorithm. 193-pepitde marker pattern exhibited high accuracy in independent validation phase with sensitivity and specificity of 69% and 80%, respectively. The proposed clinical application of the developed marker pattern would have potential in monitoring cancer recurrence and response to treatment therapy. In parallel, one relevant element related to cancer progression is post-translational modifications occurring at the protein level. Therefore, the second part of the thesis was devoted to the investigation of the presence of glycopeptides in urinary peptide profiles of healthy individuals and cancer patients with the specific focus on O- and N-glycosylation. Importantly, glycan and glycoprotein expression patterns are considered as an attractive target for the development of novel cancer biomarkers. This is highlighted by the fact that most of the FDA approved cancer biomarkers are glycans or glycoproteins (e.g. CA19-9, CA125, PSA or CEA). Following this, in the present study, a glycoproteomics workflow for glycopeptide analysis was established using the urinary profiling data derived by mass spectrometry (CE-MS and/or liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)) that allows the explorative analysis of O- and N-glycosylated intact urinary proteins without the glycan separation and/or enrichment strategy. Due to this, the information regarding glycosylation attachment site is maintained and can be used for correlation of the glycosylation variants with the disease state. Based on this analysis, a number of O- and N-glycosylated peptides (the most common types of glycosylation) in urine samples from healthy and diseased individuals was identified. The distribution of identified glycopeptides was assessed in the previously used urinary peptide CE-MS profiles of cancer patients with five different types of tumor (bladder, prostate, pancreatic cancer, cholangiocarcinoma and renal cell carcinoma). Interestingly, the significant differences in glycopeptide abundance across different cancer types compared to normal subjects were observed. Consequently, through the established glycoproteomics workflow, intact glycopeptides were identified and characterized in human urine, providing novel insights for further exploration of the glycoproteome with respect to specific diseases.$$leng
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