Microbial catalysis of renewable resources into aromatics via the central metabolic precursor phenylalanine

Otto, Maike; Wierckx, Nick; Blank, Lars M.

doi:39614

Microbial catalysis of renewable resources into aromatics via the central metabolic precursor phenylalanine = Mikrobielle Katalyse von erneuerbaren Ressourcen in aromatische Verbindungen über die zentrale Stoffwechselvorstufe Phenylalanin

Otto, Maike^RWTH*

2020

VerantwortlichkeitsangabeMaike Otto

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2020

Umfang1 Online-Ressource (XIII, 133 Seiten) : Illustrationen

ISBN978-3-86359-862-4

ReiheApplied microbiology ; 21

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Englische und deutsche Zusammenfassung. - Weitere Reihe: Edition Wissenschaft Apprimus. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Wierckx, Nick (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-01-21

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-09097
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/801837/files/801837.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
microbial (frei) ; aromatics (frei) ; catalysis (frei) ; metabolic (frei) ; renewable (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Aromaten sind vielseitige chemische Verbindungen, die in zahlreichen Anwendungen zum Einsatz kommen. Zurzeit werden die meisten Aromaten in petrochemischen Prozessen aus Rohölhergestellt, was mit der Erschöpfung fossiler Ressourcen und negativen Umweltauswirkungen einhergeht. Die mikrobielle Katalyse kann alternative Produktionskonzepte für Aromaten bieten, die erneuerbare Substrate nutzen und weniger Emissionen verursachen. Da viele Aromaten eineerhöhte Toxizität gegenüber Mikroben aufweisen, ist der Einsatz besonders robuster Wirtszellenerforderlich, um deren effiziente mikrobielle Produktion zu ermöglichen. Bakterien der Gattung Pseudomonas weisen eine besonders hohe, native Toleranz gegenüber toxischen Chemikalien auf und sind daher vielversprechende Kandidaten für die Produktion toxischer Aromastoffe. Das Ziel dieser Arbeit war die Domestizierung von Pseudomonaden für die Produktion verschiedener aromatischer Chemikalien. Die Anwendung rationaler metabolic engineering-Strategien, einschließlich der Deletion und Veränderung chromosomaler Elemente und der Überexpression heterologer Gene, führte zu Pseudomonas-Stämmen, die L-Phenylalanin effizient akkumulieren. Die Expression einer Phenylalanin-Ammoniaklyase aus der Pflanze Arabidopsisthaliana ermöglichte dann die Synthese des aromatischen Bausteins trans-Cinnamat mit Ausbeuten von bis zu 48% Cmol Cmol-1 unter Verwendung von Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle. Diese Stämme wurden als Plattform für die Herstellung weiterer chemischer Verbindungen von industriellem Interesse verwendet. Eine Ferulasäure-Decarboxylase führte zur Synthese von Styrol, das in polymerisierter Form in verschiedenen Kunststoffprodukten eingesetzt wird. Zudem wurde das pflanzliche Polyphenol Pinosylvin durch zusätzliche Expression einer4-Cumarat-Ligase aus Streptomyces coelicolor und einer Stilbensynthase aus Arachis hypogaea hergestellt. Des Weiteren beschreibt diese Arbeit die Etablierung eines neuartigen Syntheseweges für die Produktion von Benzoat durch die Enzyme des Phenylpropanoid-Abbauwegs aus Corynebacterium glutamicum. Dies ermöglichte daraufhin die Produktion von Brenzcatechol und cis, cis-Muconat über native Enzyme. Darüber hinaus wurde ein Werkzeug zur gezielten Integration heterologer Elemente in ribosomale Operons von Pseudomonas etabliert. Hier ermöglichte die hohe Aktivität ribosomaler Promotoren in Kombination mit Transkriptmodulation durch synthetische Elemente hohe Expressionsraten fremder Gene. Das Werkzeug erlaubte zudem die Analyse der verschiedenen ribosomalen Operons im Stamm Pseudomonas putida S12.Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einen rationalen Ansatz für die Entwicklung nachhaltiger Prozesse zur Herstellung von L-Phenylalanin-basierten Chemikalien. Das neuartige Werkzeug für die heterologe Genexpression liefert einen weiteren Domestizierungsansatz für Pseudomonas und bringt diesen interessanten Wirtsorganismus damit einen Schritt weiter in Richtung industrieller Applikationen

Aromatics are versatile compounds required for numerous applications used in everyday life. Today, most aromatics are produced from crude oil in petrochemical processes, which goes along with fossil resource depletion and negative environmental impacts. Microbial catalysis can offer alternative production concepts for aromatics, in processes that utilize renewable substrates and cause less emissions. As many aromatics display enhanced toxicity towards microbes, the utilization of especially robust host cells is required to allow their efficient microbial production. Bacteria of the genus Pseudomonas thrive in challenging environments and possess the native ability to cope with many different chemicals and are thus promising candidates for the production of toxic aromatics. The aim of this thesis was the domestication of Pseudomonas species to produce various aromatic chemicals. For this, the aromatic amino acid L-phenylalanine was defined as inherent precursor. The application of rational metabolic engineering strategies, including the deletion and alteration of chromosomal elements and the overexpression of heterologous genes, resulted in Pseudomonas taiwanensis chassis strains that efficiently accumulate L-phenylalanine. The expression of a phenylalanine ammonia lyase from the plant Arabidopsis thaliana then allowed synthesis of the aromatic building block trans-cinnamate with yields of up to 48% Cmol Cmol-1using glycerol as sole carbon source. These strains were then used as platform to produce several chemical compounds of industrial interest. A ferulic acid decarboxylase led to the production of styrene, the monomer of polystyrene, which is used in different plastic products. In another approach, the plantpolyphenol pinosylvin was produced using the t-cinnamate-producing chassis strains by additional expression of a 4-coumarate ligase from Streptomyces coelicolor and a stilbene synthase from Arachis hypogaea. This work further describes the establishment of a novel pathway for the production of benzoate via enzymes of the phenylpropanoid degradation pathway of Corynebacterium glutamicum, which also allowed the production catechol and cis,cismuconatevia native pathways of Pseudomonas. In addition, a novel tool for the targeted integration of heterologous genetic elements into ribosomal operons of Pseudomonas was established. Here, the high activity of ribosomal promoters in combination with transcript-modulation by synthetic elements allowed high expression rates of foreign genes. The tool furthermore allowed analysis of the different ribosomal operons in the strain Pseudomonas putida S12. In summary, this thesis describes a rational approach towards the development of sustainable processes for the production of a variety of L-phenylalanine derived chemicals. The novel tool for heterologous gene expression delivers a further engineering approach of highly versatile Pseudomonas species, thereby bringing the application of this interesting host one step closer towards efficient industrial processes.

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