Deep genome editing of Pseudomonas putida for rhamnolipid production using non-conventional substrates

Bator, Isabel; Blank, Lars M.; Jaeger, Karl-Erich

doi:39984

Deep genome editing of Pseudomonas putida for rhamnolipid production using non-conventional substrates

Bator, Isabel^RWTH*

2021

VerantwortlichkeitsangabeIsabel Bator

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2021

Umfang1 Online-Ressource (XV, 184 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

ISBN978-3-86359-931-7

ReiheApplied microbiology ; 24

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Druckausgabe: 2021. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Jaeger, Karl-Erich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-12-08

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2021-00901
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/811050/files/811050.pdf

Einrichtungen

Projekte

BioSC - Bioeconomy Science Center (BioSC) (BioSC)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pseudomonas (frei) ; metabolic engineering (frei) ; renewable substrates (frei) ; rhamnolipids (frei) ; synthetic biology (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Biotenside, wie z.B. Rhamnolipide, sind wertvolle Produkte mit vielen möglichen Anwendungen. Aufgrund ihrer amphiphilen Struktur können sie in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden. Das Gesamtziel dieser Arbeit war die Produktion von Rhamnolipiden aus nachwachsenden Substraten unter der Verwendung des nicht-pathogenen Pseudomonas putida KT2440, was zu einer nachhaltigen Bioökonomie beitragen würde. Es wurden verschiedene Substrate eingesetzt, die neue Einblicke in den jeweiligen Metabolismus ermöglichten. Um die Produktionskosten zu reduzieren, können lignocellulose-abgeleitete Substrate, wie Xylose und Galacturonsäure, genutzt werden. Während P. putida Galacturonsäure natürlich verwerten kann, führt das Nutzen von Xylose zu keinem Zellwachstum. Es wurden drei bakterielle Xylose-Stoffwechselwege eingebracht und die modifizierten Stämme wurden bezüglich ihres Wachstums und ihrer Produktion charakterisiert. Während der Einsatz der oxidativen Xylose-Wege zu einer höheren Biomasseproduktion und höheren Rhamnolipid-Titern führte, war die Produktausbeute für den Isomerase-Weg besser aufgrund der unterschiedlichen Stöchiometrien der Wege. Die Rhamnolipidproduktion aus Galacturonsäure war direkt effizient. Die Produktionsrate wurde jedoch durch Laborevolution gesteigert. Ethanol ist eine weitere nachhaltige Kohlenstoffquelle, da es mittels Mikroben aus lignocellulosehaltiger Biomasse hergestellt werden kann. Eine Laborevolution wurde durchgeführt, um einen Stamm mit hoher Wachstumsrate auf Ethanol bei erhöhten Konzentrationen zu erhalten. Genom-Resequenzierung und Genexpressions-Studien offenbarten ein Umsteuern des Metabolismus für eine kohlenstoffeffiziente Ethanolverstoffwechselung. Der resultierende Biotensidproduzent wurde in einem Fed-Batch Prozess eingesetzt, bei dem das wasserlösliche Ethanol als Kohlenstoffquelle und Entschäumer diente. Dieser einzigartige Aufbau ermöglichte eine Biotensidproduktion von über 5 g/L innerhalb eines Tages mit einer großartigen Raum-Zeit-Ausbeute von 0.23 g/L/h. Zusätzlich wurde P. putida KT2440 modifiziert, um genomreduzierte Chassis durch die gezielte Entfernung von überflüssigen Elementen oder Prozessen zu generieren. Einige Deletionen führten zu einer um 66% gesteigerten Rhamnolipidproduktion. Da die Zufuhr von Vorläufermolekülen als möglicher Engpass galt, wurde die Überexpression der Phosphoglucomutase und des Rhamnose-Operons durchgeführt. Die Kombination der reduzierten Chassis und der Überexpression konnte die Rhamnolipidproduktion weiter auf bis zu 94% steigern. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit deutlich, dass die Rhamnolipidproduktion aus nachwachsenden Substraten realisierbar ist. Des Weiteren wird der Einsatz von P. putida KT2440 als mikrobielle Zellfabrik in industriellen Prozessen demonstriert. Eine Kombination der verbesserten Chassis und der Verwendung eines beliebigen nachwachsenden Lignocellulose-abgeleitetem Substrat wird wahrhaftig dazu beitragen einen wettbewerbsfähigen Produktionsprozess zu etablieren.

Biosurfactants, such as rhamnolipids, are valuable products with many potential applications. Their amphiphilic structure allows their use in different fields. The overall aim of this thesis was to produce rhamnolipids from renewable substrates using the nonpathogenic Pseudomonas putida KT2440, which would contribute to a sustainable bioeconomy. Various substrates were implemented, which allowed new insights into the respective metabolism. In order to reduce the costs for rhamnolipid production, lignocellulose-derived substrates, such as xylose and galacturonic acid, can be used. While P. putida can natively utilize galacturonic acid, the use of xylose does not lead to growth. Three bacterial xylose utilization pathways were introduced and the engineered strains were characterized regarding their growth and production. While the implementation of the oxidative xylose pathways resulted in higher biomass production and rhamnolipid titers, the product yield was higher for the Isomerase pathway caused by the different stoichiometries of the pathways. Rhamnolipid production from galacturonic acid was immediately efficient, however the production rate was improved by laboratory evolution. Ethanol is another sustainable carbon source as it can be produced out of lignocellulosic biomass by microbes. Laboratory evolution was applied to obtain a strain with a high growth rate on ethanol at elevated concentrations. Genome re-sequencing and gene expression studies revealed a rerouting of the metabolism for carbon-efficient ethanol utilization. The resulting biosurfactant producer was used in a fed-batch process, where the water-soluble ethanol served as carbon source and defoamer. This unique setup enabled a biosurfactant production of over 5 g/L in one day with a great space time yield of 0.23 g/L/h. In addition, P. putida KT2440 was modified to generate a genome-reduced chassis by targeted deletion of dispensable elements or processes. Several deletions led to a 66% improved rhamnolipid production. As precursor supply seemed to be a bottleneck, the overexpression of the phosphoglucomutase and rhamnose-operon was performed. The combination of a reduced genome and the overexpression further increased the rhamnolipid production up to 94%. In conclusion, this thesis clearly illustrates that rhamnolipid production from renewable substrates is feasible. Further, the application of P. putida KT2440 as microbial cell factory inindustrial processes is demonstrated. A combination of the improved chassis and the use of any renewable lignocellulose-derived substrate will truly contribute to establish a competitive production process.

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