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000816099 245__ $$aUntersuchungen zur elektrochemischen Regulation der Musterbildung im Ovar von Drosophila melanogaster$$cvorgelegt von Susanne Katharina Schotthöfer, M.Sc.$$honline
000816099 246_3 $$aInvestigations on the electrochemical regulation of pattern formation in the ovary of Drosophila melanogaster$$yEnglish
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000816099 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
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000816099 5203_ $$aEntwicklungs- und Regenerationsprozesse werden unter anderem von interzellulären bioelektrischen Signalen gesteuert. Dabei nehmen zellübergreifende Membranpotential (Vmem)- und intrazelluläre pH-Wert (pHi)-Änderungen, wie elektrochemische Gradienten, Einfluss auf Zytoskelettorganisation und planare Zellpolarität. Der Schwerpunkt dieser Arbeit besteht darin, einige der Regulation zugrundeliegenden Ionentransportmechanismen und Signalwege zu identifizieren und bereits früher gewonnene Erkenntnisse einer erneuten Analyse mittels genetisch basierter Methoden zu unterziehen. Die Festlegung der Achsenpolarität gehört zu den Entwicklungsprozessen, für die eine elektrochemische Regulation belegt ist und Korrelationen zwischen bioelektrischer Polarität und Zytoskelettpolarität angenommen werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten eindeutige Belege dafür gefunden werden, dass im Wildtyp von Drosophila und in der Achsenpolaritätsmutante gurken (grk) bioelektrische Polarität und Zytoskelettpolarität in einer engen Beziehung zur Achsenpolarität während der Oogenese stehen. Aufgrund einer gestörten anterior-posterioren (A-P)-Polarität in grk zeigte das Follikelepithel (FE) im Stadium 9 einen signifikant flacheren A-P-Vmem-Gradienten als der Wildtyp und Veränderungen in der Zytoskelettorganisation. Am deutlichsten waren die Unterschiede bei der Entstehung der dorsal-ventralen (D-V)-Polarität im Stadium 10B zu erkennen. Während im Wildtyp gleichzeitig mit einer morphologischen D-V-Polarität deutliche D-V elektrochemische Gradienten und charakteristische stadienspezifische basale Mikrofilament- und Mikrotubuli-Muster auftraten, fehlten transversale elektrochemische Gradienten und charakteristische Zytoskelett-Muster ebenso wie eine morphologische D-V-Polarität in grk. Daraus lässt sich ableiten, dass eine fehlende Signalgebung über Grk-EGFR Einfluss auf die asymmetrische Verteilung oder Aktivierung von Ionentransportmechanismen und Gap Junctions nimmt. Als Folge werden elektrochemische Gradienten beeinflusst, bestimmte Veränderungen in der Organisation des Zytoskeletts bleiben aus und die Morphologie des FE ändert sich. Bereits identifizierte Ionentransportmechanismen im FE wurden unter Verwendung des genetisch codierten Vmem-Sensors ArcLight und des pHi-Sensors pHluorin-Moesin sowie spezifischer Inhibitoren überprüft und spezifiziert. Die Inhibitionsexperimente mit den genetisch codierten Sensoren bestätigen, dass die betreffenden Ionentransportmechanismen eine entscheidende Rolle bei der Generierung bioelektrischer Signale im FE einnehmen. Es konnten signifikante Vmem- und pHi-Änderungen detektiert werden, die den mit Hilfe der spannungs- und pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen DiBAC und CFDA ermittelten, vergleichbar sind. Durch einen RNAi-Screen konnten fünf Ionentransportmechanismen- und Gap Junction-Gene ausfindig gemacht werden, welche die Entwicklung des Ovars und/oder die Oogenese beeinflussen. Ein kompletter Verlust der Ovarien oder eine verringerte Größe waren als Folge des Somaknockdowns der Innexine inx1, inx3 und des DEG/ENaC-Mitglieds ripped pocket (rpk), sowie infolge des Keimbahnknockdowns von rpk zu beobachten. Ein im Soma durchgeführter Knockdown der V-ATPase-Untereinheit B vha55 führte zu größenreduzierten Ovarien mit degenerierten Follikeln ab Stadium 10A. Aufgrund der penetranten Phänotypen in den Knockdowns wird die Hypothese aufgestellt, dass die induzierte elektrochemische Fehlregulation einen massiven Einfluss auf die Organisation des Zytoskeletts hat, wodurch die Differenzierung von z. B. somatischen Stammzellen gestört und die Ovarmorphologie oder die Follikelentwicklung grundlegend beeinträchtigt werden. Vergleichbar den veränderten Zytoskeletteigenschaften in grk, führte der Somaknockdown des open rectifier K+ channel 1 (ork1) zu veränderten basalen Mikrofilament- und Mikrotubuli-Mustern. Als Folge zeigen entsprechende ork1-Follikel einen charakteristischen round-egg-Phänotyp, der dem bekannter round-egg-Mutanten ähnelt. Diese Mutanten werden mit dem Fat2-vermittelten Signalweg zur Ausbildung planarer Zellpolarität im FE in Verbindung gebracht. Zusammengefasst liefern die Ergebnisse dieser Arbeit weitere Hinweise auf eine elektrochemische Regulation von Entwicklungsprozessen durch die Beeinflussung von Signalwegen und Zytoskelettelelementen. Die Analysen der RNAi-Knockdowns und der Mutante grk deuten darauf hin, dass elektrochemische Fehlregulationen essentielle Funktionen während der Ovarentwicklung und Oogenese von Drosophila beeinträchtigen. Änderungen der bioelektrischen Eigenschaften verursachen Veränderungen in der Organisation des Zytoskeletts. Diese äußern sich in einer veränderten Morphologie des FE oder des gesamten Follikels.$$lger
000816099 520__ $$aSeveral developmental and regenerative processes are known to be controlled by bioelectrical signals. Transcellular changes in membrane potential (Vmem)- and intracellular pH (pHi)-patterns, like electrochemical gradients, affect cytoskeletal organisation and planar cell polarity. The main focus of the present study was the identification of ion-transport mechanisms and signalling pathways that form the basis of this electrochemical regulation, and the evaluation of earlier results using genetic methods. Axis formation is one of several developmental processes for which electrochemical regulation has been demonstrated, and connections between bioelectrical polarity and cytoskeletal polarity are therefore assumed. The present study clearly indicates that bioelectrical polarity and cytoskeletal polarity are closely linked to axial polarity in Drosophila wild-type and gurken (grk) mutant follicles during the course of oogenesis. Corresponding to a disturbed morphological anterior-posterior (a-p) polarity in grk, the follicular epithelium (FE) showed, in stage 9, a significantly reduced a-p Vmem-gradient compared to wild type and changes in cytoskeletal organisation. The most striking differences were visible during stage 10B when dorsal-ventral (d-v) polarity is established. Concurrent with morphological d-v polarity, significant d-v electrochemical gradients and characteristic stage-specific basal microfilament and microtubule patterns emerged in the wild type. In grk, however, comparable transversal electrochemical gradients, characteristic cytoskeletal patterns and a morphological d-v polarity were absent. Presumably, missing Grk-EGFR signalling acts influence on the asymmetric distribution or activation of ion-transport mechanisms and gap junctions. Consequently, electrochemical gradients are influenced, alterations in cytoskeletal organisation fail to occur, and the morphology of the FE changes. Previously identified ion-transport mechanisms in the FE were reevaluated using the genetically-encoded Vmem-sensor ArcLight and the pHi-sensor pHluorin-Moesin in combination with specific inhibitors. The inhibition experiments using the genetically-encoded sensors confirm that the targeted ion-transport mechanisms play important roles in generating bioelectrical signals in the FE. We detected significant Vmem- and pHi-changes which are comparable to previously described changes using the voltage- and pH-sensitive fluorescent dyes DiBAC and CFDA. In a RNAi-knockdown screen, five genes of ion-transport mechanisms and gap-junction subunits were identified excerting influence on ovary development and/or oogenesis. Complete loss of ovaries or small ovaries were observed as results of soma knockdowns of the innexins inx1 and inx3, and of the DEG/ENaC family member ripped pocket (rpk), as well as of germline knockdown of rpk. Soma knockdown of the V-ATPase-subunit vha55 caused size-reduced ovaries with degenerating follicles from stage 10B onward. The highly penetrant knockdown phenotypes suggest that the induced electrochemical dysregulation has massive impact on cytoskeletal organisation. Accordingly, differentiation of somatic stem cells as well as ovary morphology or the development of follicles are disturbed.Comparable to changes in cytoskeletal properties in grk, soma knockdown of the open rectifier K+ channel 1 (ork1) resulted in altered basal microfilament and microtubule patterns. ork1-follicles show a characteristic round-egg phenotype, resembling the phenotype of known round-egg-mutants. Round-egg mutants have been associated with the Fat2 planar cell-polarity pathway in the FE. In summary, the results of this study provide further evidence for electrochemical regulation of developmental processes via the control of signalling pathways and cytoskeletal elements. As the analysis of RNAi-knockdowns and the mutant grk indicate, electrochemical dysregulation affects essential functions during Drosophila ovary development and oogenesis. Changes in bioelectrical properties cause alterations in the organisation of the cytoskeleton, which finally result in altered morphology of the FE and the whole follicle.$$leng
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