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000816648 1001_ $$0P:(DE-82)IDM00756$$aAnand, Deepak$$b0$$urwth
000816648 245__ $$aChiral separation of arginine based on tailor-made FhuA β-barrel protein$$cvorgelegt von Master of Science (M.Sc.)Biotechnologie Deepak Anand$$honline
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000816648 3367_ $$0PUB:(DE-HGF)11$$2PUB:(DE-HGF)$$aDissertation / PhD Thesis$$bphd$$mphd
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000816648 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2021
000816648 502__ $$aDissertation, RWTH Aachen University, 2020$$bDissertation$$cRWTH Aachen University$$d2020$$gFak01$$o2020-04-20
000816648 5203_ $$aDie Chiralität chemischer Verbindungen ist in der Natur allgegenwärtig und spielt eine zentrale Rolle im Stoffwechsel vieler Nährstoffe und Pharmazeutika. Obwohl Enantiomere einer Verbindung ähnliche chemische und physikalische Eigenschaften aufweisen, können sie eine völlig unterschiedliche biologische Aktivität aufweisen. Daher sind chirale Moleküle in der chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie von großem wirtschaftlichem Wert. Viele Anwendungen in diesen Industrien erfordern die Isolierung und Verwendung einzelner chiraler Isomere (Enantiomere) von chiralen Verbindungen. Infolgedessen besteht ein immer größerer Bedarf an optisch reinen Verbindungen. Die Deckung dieses Bedarfs an optisch reinen Enantiomeren ist stellt eine zentrale Herausforderung in der biotechnologischen Industrie dar. Seit der ersten optischen Auflösung von Weinsäure, die Louis Pasteur Anfang 1848 durchführte, wurden verschiedene Techniken für die chirale Auflösung von Enantiomerenverbindungen entwickelt. Verfahren wie chromatographische oder enzymatische Techniken werden üblicherweise verwendet. Sie sind jedoch durch Schwierigkeiten bei Großproduktionen begrenzt. Die Kristallisation kann in großem Maßstab eingesetzt werden, häufig sind jedoch mehrere Kristallisations- und Rekristallisationsrunden erforderlich, um enantiomerenreine Verbindungen zu erhalten, da das unerwünschte Enantiomer während des Kristallwachstums eingeschlossen ist, was häufig zu einer signifikanten Verringerung der Ausbeuten führt (bis zu 50%).Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Vor- und Nachteile, wobei der membranbasierte Ansatz aufgrund seiner Verwendung im Dauerbetrieb und seiner einfachen Skalierbarkeit von besonderem Interesse ist. Das Problem mit der bisher entwickelten membranbasierten Technologie ist jedoch die ungleichmäßige Porengröße, sowie die begrenzte Anzahl von Poren. Von der Natur inspiriert, können membranbasierte Ansätze zur chiralen Trennung unter Verwendung eines Barrel-Proteins eine geeignete Alternative sein. Chirale Protein-Polymer-Membranen wären eine attraktive, kostengünstige und skalierbare Methode. Die Hauptherausforderungen liegen jedoch im Design von „Filterregionen“ und der Erzeugung von „Screeningsystemen“ zur Identifizierung von chiralen Kanalproteinen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Eisenhydroxamat-Aufnahmekomponente A (FhuA) so konstruiert, dass ein chiraler Kanal zur Trennung von Arginin-Enantiomeren erzeugt wird, der als Gerüst für die Erzeugung einer Protein-Polymer-Membran verwendet werden kann. FhuA ist ein großes monomeres Transmembranprotein von Escherichia coli, das sich zu einem Zylinder faltet, der aus 22 antiparallelen β-Strängen und einer tonnenverschließenden „Korkdomäne“ besteht. FhuA wurde aufgrund seiner hohen Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln, seiner Wärmebeständigkeit und seiner hohen Robustheit gegenüber Reengineering Ansätzen, als funktionelle Nanopore ausgewählt. Strukturell enthält FhuA einen Wasserkanal, in dem zwei flexible Schleifen in der Korkdomäne (Schleife 1; Rest 35-40 und Schleife 2; Reste 135-145) verkürzt wurden, um zwei Selektivitätsfilterbereiche (Filter 1 und Filter 2) zu erzeugen. Zusätzlich wurde die Korkdomäne innerhalb des Fasses durch Substitution von drei Aminosäuren (Q62D, R81W und N117L) stabilisiert, was zur Erzeugung einer FhuA∆L-Variante mit einer höheren Wechselwirkung zwischen Fass und Korkdomäne führte. Um eine chirale selektive Variante zu erzeugen, wurde ein gerichtetes Evolutionsprotokoll entwickelt, um eine chirale FhuA∆L-Variante zu erzeugen. Ein neues kalorimetrisches Ganzzell-Screeningsystem auf der Basis eines Aminosäuren-umsetzenden Enzyms (Arginin-Deiminase) wurde entwickelt, um die enantioselektive Variante aus mutierten Bibliotheken von FhuA∆L zu identifizieren. Das Screening von Mutantenbibliotheken führte zur Identifizierung der FhuAF4-Variante (Aminosäuresubstitutionen: G134S, G146T), die einen ungefähr zweimal höheren Transport von L-Arginin im Vergleich zu Eltern-FhuA∆L mit E-Wert = 1,92 zeigte; ee% = 23,91 bei 52,39% Umwandlung. Gesteuerte Molekulardynamik (SMD) wurden simuliert, um das molekulare Verständnis der beobachteten veränderten Enantiopreferenz der FhuAF4-Variante gegenüber L-Arginin im Vergleich zur FhuA∆L-Variante zu verstehen. In der FhuA∆L-Variante wurden weniger Wechselwirkungen von D- und L-Arginin mit der Filterregion 2 beobachtet und beide Enantiomere passieren frei. Interessanterweise wird in der FhuAF4-Variante der Transport von D-Arginin behindert und der gesteuerte Transport verlangsamt, was durch eine längere Verweilzeit nahe dem Selektivitätsfilterbereich 2 angezeigt wird. Die erhaltenen Ergebnisse liefern einen ersten Beweis für das Prinzip der Konstruktion eines Membranproteins zur chiralen Trennung von Aminosäuren und geben einen Einblick in den Mechanismus der chiralen Trennung innerhalb des FhuA-Kanals. Es ist wahrscheinlich, dass mit der identifizierten Filterregion und den OmniChange-Bibliotheken weitere Verbesserungen für andere Aminosäuren und ein breiteres Spektrum von Enantiomeren erzielt werden könnte. Die chiralen FhuA-Kanalproteine wären ein hervorragendes Gerüst für die Erzeugung einer chiralen Membran auf der Basis von Proteinpolymerkonjugaten mit einem hohen Potenzial für neuartige und skalierbare nachgeschaltete Prozesse in der Pharma- und Lebensmittelindustrie.$$lger
000816648 520__ $$aChirality of chemical compound is ubiquitous in nature performing central function in metabolism of many nutrients and pharmaceuticals. Even-though enantiomers of a compound have similar chemical and physical properties it can have completely different biological activity. Thus chiral molecules are of large economic value in chemical, pharmaceutical, and food industries. Many applications in these industries require the isolation and use of single chiral isomers (enantiomers) of chiral compounds. As a result, there is an ever increasing necessity of optically pure compounds but it is a challenging task to obtain it. Since the first optical resolution of tartaric acid, performed by Louis Pasteur in early 1848, various techniques have been developed for chiral resolutions of enantiomeric compounds. Methods such as chromatographic or enzymatic techniques are commonly used. However, they are limited by difficulties for large-scale productions. Crystallization can be used in large-scales but often several rounds of crystallization and recrystallization are required to obtain enantiopure compounds due to entrapments of the unwanted enantiomer during crystal growth, which often leads to significant reduction in yields (up to 50 %). Each and every one of these techniques has their own advantages and disadvantages but the membrane based approach is of particular interest because of its use in continuous operation and its ease of scale-up. But the problem with the membrane based technology developed till now is that of non-uniform pore size and limited number of pores. Inspired by nature, membrane-based approaches for chiral separation using a barrel protein can be a suitable alternative. Chiral protein-polymer membranes would be an attractive, cost-effective, and scalable method. However, the main challenges lie in the design of “filter regions” and the generation of “screening systems” to identify chiral channel proteins. In the present thesis, ferric hydroxamate uptake component A (FhuA) was engineered to generate chiral channel for separation of arginine enantiomers which can be used as a scaffold for the generation of protein-polymer membrane. FhuA is a large monomeric transmembrane protein of Escherichia coli which folds into a barrel consisting of 22 antiparallel β-strands and a barrel-plugging “corkdomain”. FhuA was chosen as a functional nanopore because of its high tolerant towards organic solvents, thermal resistant, and has a high robustness towards reengineering. Structurally, FhuA contains a water channel wherein two flexible loops in the cork domain(loop1; residue 35-40 and loop2; residues 135-145) were shortened to generate two selectivity filter regions (filter1 and filter2). Additionally, cork domain was stabilized inside the barrel by substituting three amino acids (Q62D, R81W, and N117L) resulting in generation of FhuAΔLvariant having higher interaction between barrel and cork domain. In order to generate a chiral selective variant, a directed evolution protocol was developed to generate a chiral FhuAΔLvariant. A novel whole cell calorimetric screening system based on amino acid utilizing enzyme (argininedeiminase) was developed in order to identify the enantioselective variant from mutant libraries of FhuAΔL. Screening of mutant libraries led to the identification of FhuAF4 variant (amino acid substitutions: G134S, G146T) showing approximately two times higher transport of L-arginine compared to parent FhuAΔL with E-value=1.92; ee %=23.91 at 52.39 % conversion. Steered molecular dynamics (SMD) simulations were carried out for molecular understanding of observed altered enantiopreference of FhuAF4 variant towards L-arginine compared to the FhuAΔL variant. In FhuAΔL variant, less interactions of both D- and L-arginine with the filter region 2 were observed and both enantiomers pass freely. Interestingly, in FhuAF4 variant, transport of D-arginine is hindered and steered transport is slowed down, indicated by a longer residence time close to the selectivity filter region 2. The obtained results provide first proof of principle of engineering of a membrane protein towards chiral separation of amino acids and provide insight into the mechanism of chiral separation within the FhuA channel. It is likely that with the identified filter region and OmniChange libraries further improvements are achievable for other amino acids and a broader range of enantiomers. The chiral FhuA channel proteins would be an excellent scaffold for generation of chiral membrane based on protein polymer conjugates with a high potential for novel and scalable downstream processes in pharmaceutical and food industries.$$leng
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