Directed evolution of a subtilisin Carlsberg variant towards increased oxidative stability

Vojcic, Ljubica; Schwaneberg, Ulrich

doi:999910243096

Directed evolution of a subtilisin Carlsberg variant towards increased oxidative stability = Gelenkte Evolution einer Subtilisin Carlsberg Variante für gesteigerte oxidative Stabilität

Vojcic, Ljubica (Author)

2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Ljubica Vojcic

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

UmfangIII, 321 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-04-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-41229
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/82822/files/4122.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Proteindesign (Genormte SW) ; Subtilisin Carlsberg (Genormte SW) ; Naturwissenschaften (frei) ; enzyme resistance (frei) ; peroxycarboxylic acids (frei) ; perhydrolysis (frei) ; enzyme promiscuity (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 500

Kurzfassung
Serinproteasen sind bedeutende Enzyme, welche überwiegend in der Waschmittelindustrie eingesetzt werden. Die kürzlich beschriebene Subtilisin Carlsberg Variante Thr59Ala/Leu217Trp (SC Perhydrolase) ist eine potentiell interessante Hydrolase für die Industrie. Die Schlüsselfunktion dieser Variante ist ihre Fähigkeit zusätzlich zur Hydrolyse auch die Perhydrolyse von Estern in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid zu katalysieren, wodurch Peroxycarboxylsäure hergestellt wird. Der Einsatz der SC Perhydrolase für die in situ Herstellung von Peroxycarboxylsäuren mittels Perhydrolyse von Estern oder Amiden in Verbindung mit Wasserstoffperoxid stellt einen alternativen Ansatz zur konventionellen Peroxycarboxylsäuren Produktion dar. Jedoch sind das perhydrolytische Aktivitätsniveau und die oxidative Stabilität der SC Perhydrolase noch weit von den industriell benötigten Standards entfernt. Um die perhydrolytische Leistung und die oxidative Stabilität der SC Perhydrolase zu steigern wurde die gelenkte Evolution eingesetzt. Es wurde ein optimiertes Mikrotiterplattenexpressionssystem eingesetzt und ein neues Transformationsprotokoll für den Expressionsstamm Bacillus subtilis DB104 entwickelt. Die Transformationseffizienz betrug 105 CFU/µg DNA. Die Assays zur Bestimmung der perhydrolytischen und proteolytischen Aktivität wurden entwickelt und für die Hochdurchsatzdurchmusterung (HTS: High Throughput Screening) angepasst. Die Durchmusterung zweier Sättigungsmutagenesebibliotheken auf gesteigerte oxidative Stabilität resultierte in einem Set aus neun SC Perhydrolase Varianten. Die identifizierten Aminosäuresubstitutionen wurden in zwei Varianten M7 (Trp217Met) und M4 (Trp217Leu/Met222Cys) kombiniert. Diese beiden Varianten zeigten eine um das 4.5-fache (M7) bzw. 2.2-fache (M4) gesteigerte oxidative Stabilität, bei einem moderaten Verlust (1.4-fache Reduktion der kcat Werte) der perhydrolytischen Aktivität für Methylbutyrat. Die Analyse der vorteilhaften Aminosäuresubstitutionen zeigte, dass der Austausch von oxidationssensitiven gegen oxidationsresistente Aminosäuren in unmittelbarer Nähe der aktiven Zentrums zu Varianten führt, die zwar eine geringe Aktivität aufwiesen aber trotzdem ihre Funktionalität behielten. Weiterführende Analysen zeigten, dass die Lösemittelzugänglichkeit der Aminosäurereste ihr Oxidationslevel bestimmt und es folglich zur Inaktivierung des Enzyms kommt. Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Studie der katalytischen Vielfältigkeit/Promiskuität von SC Perhydrolase und die Steigerung der katalytischen Effizienz gegenüber Diacetatestern unter Einsatz der gelenkten Evolution. Diacetatester stellen ein attraktives Substrat für industrielle Anwendung dar. Der Hauptansatz der direkten Evolutionsstudie war das Durchmustern von Mutantenbibliotheken, die mittels fehlerhafter PCR (epPCR) und positionsspezifischer Sättigunsmutagenese (SSM) generiert wurden. Die positionsspezifischen Sättigungsmutagenesen wurden an Positionen durchgeführt, welche durch Docking-Analysen und visueller Untersuchung des Subtilisin Carslberg Modells als erfolgsversprechend eingestuft wurden. Eine Mikrotiterplattendurchmusterung wurde mittels eines neuartigen Fluoreszenz-Assay für die Detektion von in situ generierten Peroxycarboxylsäuren durchgeführt. Obgleich keine Variante mit gesteigerter katalytischer Effizienz gegenüber Diacetatestern identifiziert wurde, konnte die Untersuchungen von molekularen Wechselwirkungen zwischen der SC Perhydrolase und dem Estersubstrat dazu beitragen Erkenntnisse zu den molekularen Hintergründen der katalytischen Promiskuität der SC Perhydrolase zu erlangen. Diese neuen Erkenntnisse könnten in Zukunft für die Entwicklung von Enzymvarianten mit verbesserter perhydrolytischer Aktivität, gegenüber geeigneteren Estersubstraten, hilfreich sein.

Serine proteases are very important enzymes employed mainly in detergent industry. A recently described Subtilisin Carlsberg variant Thr59Ala/Leu217Trp (SC Perhydrolase) is a potentially important industrial hydrolase. The key feature of this variant is its ability to catalyse perhydrolysis, in addition to hydrolysis, forming peroxycarboxylic acids in the presence of esters and hydrogen peroxide. Employing SC Perhydrolase for in situ generation of peroxycarboxylic acids by hydrolysis of esters or amides in the presence of hydrogen peroxide is an alternative approach for producing peroxycarboxylic acids when required in application. However, the level of perhydrolytic activity of SC Perhydrolase is still not sufficient to be used in industrial scale since its activity and oxidative stability are far from the industry required standards. In order to enhance the perhydrolytic performance and the oxidative stability of this Subtilisin variant the directed evolution was performed. An optimized microtiter plate expression system in Bacillus subtilis DB104 along with a transformation protocol for a particular Bacillus strain (DB104) were established yielding 105 transformants per µg DNA. The assays for the detection of perhydrolytic and proteolytic activity were developed and optimized for high throughput screening (HTS). Screening of two site saturation mutagenesis libraries for increased oxidative stability resulted in a set of nine SC Perhydrolase variants. Amino acid substitutions were identified and combined into two variants M7 (Trp217Met) and M4 (Trp217Leu/Met222Cys) with increased oxidative resistance for 4.5-fold (M7) and 2.2-fold (M4). The kcat values for perhydrolysis of methylbutyrate of these two variants moderately decreased for 1.4-fold. The analysis of beneficial substitutions showed that the oxidation-sensitive amino acids close to the active site can be replaced with oxidation-resistant residues resulting in a less active but functional variant. Further analysis revealed that solvent exposure of amino acid residues could determine the level of its oxidation and subsequently inactivation of the enzyme. The investigation on the catalytic promiscuity in SC Perhydrolase and employing directed evolution for engineering its catalytic efficiency towards diacetate esters as an attractive substrate for industrial application was the second goal of the thesis. The main approach in the directed evolution campaign was screening error prone PCR (epPCR) and site saturation mutagenesis (SSM) libraries having mutations at positions proposed after docking analysis and visual inspection of the Subtilisin Carlsberg model. A microtiter plate screening was performed using a novel fluorescent assay for the detection of in situ generated peroxycarboxylic acids. Although a variant with increased catalytic efficiency towards diacetate ester was not identified, the investigation of molecular interactions between SC Perhydrolase and the ester substrate contributed to gain a significant insight in understanding of molecular reasons for the catalytic promiscuity in SC Perhydrolase. The novel insights can be helpful for designing enzyme variants with improved level of perhydrolysis towards more suitable ester substrates in the future.

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