Biomimetic coatings on technical substrates for cell culture

Svetlova, Anastasia; Pich, Andrij; Offenhäusser, Andreas

doi:10.18154/RWTH-2022-01542

Biomimetic coatings on technical substrates for cell culture

Svetlova, Anastasia^RWTH*

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von specialist in chemistry Anastasia Svetlova

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Englische und deutsche Zusammenfassung. - Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor)^RWTH* ; Pich, Andrij (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-01-24

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-01542
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/841188/files/841188.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
bioelectronics (frei) ; biomimetic coatings (frei) ; blebbing (frei) ; cell adhesion (frei) ; graphene (frei) ; supported lipid bilayers (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 530

Kurzfassung
Die Fähigkeit, lebende Zellen mit nicht-invasiven Methoden wie Zellkultur zu untersuchen, war eine Grundlage für moderne biologische und biotechnologische Fortschritte. Als entdeckt wurde, dass eine Zellfunktion nicht von ihrer Umgebung getrennt werden kann, begann die Suche nach lebendem Gewebe unter kontrollierten Laborbedingungen. Die Forscherversuchen ständig, die Methodik zu verbessern, um Zellen in Umgebungen zu untersuchen, die natürlichen Gewebeumgebungen am ähnlichsten sind. Die Schaffung komplexer Umgebungen erfordert eine genaue Kontrolle der Eigenschaften des darunterliegenden Substrats. Das Projekt umfasste die Entwicklung der Beschichtung, die eine natürliche Zellmembrannachahmt und eine geeignete Plattform für die Zellkultur darstellt, sowie die Anpassung des elektrischen Messsystems. Als Basis für die biomimetischen Beschichtungen wurden festkörpergestützte Lipiddoppelschichten (SLBs) und als Messsystem Graphen-Feldeffekt-transistoren (GFETs) verwendet. Die größte Herausforderung des ersten Teils bestand darin, die Hydrophobizität der Graphenoberfläche zu überwinden, da auf dem unberührten Graphen keine Lipiddoppel-schichten gebildet werden können. Eine elektrochemische Oxidation wurde getestet, um Hzdrophobizität zu senhen. Es zeigte sich jedoch, dass chemisch aufgedampftes (CVD)Graphen mit diesem Verfahren nicht kompatibel ist, da der Prozess anstelle der einheitlichen Funktionalisierung die Schichtintegrität zerstörte. Neben dem Thema eines Zusammenhangszwischen elektrochemischen Eigenschaften und Oberflächenqualität wurden detaillierte Untersuchungen zur Entstehung der Leckströme von Graphen-Elektrolyt-Transistoren durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass der daraus resultierende Wert verwendet werden kann, um die Oberflächeneigenschaften von Graphen in situ zu bewerten und zu überwachen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Veröffentlichungen zusammengefasst [1, 2].Zur Herstellung biomimetischer Beschichtungen wurden Extrakte aus Zellmembranen von HEK293-Zellen durch das chemische Vesikulationsverfahren hergestellt. Die Ähnlichkeit des strukturellen Rückgrats von Zellvesikeln und SLBs aus künstlichen Lipidmischungen ermöglicht es ihnen, zu Verbundschichten zu verschmelzen. Durch die Anreiderung mit Zellmembranmolekülen wie Glycolipiden und Proteinen wurde die Möglichkeit einer Zell-Zell-Wechselwirkung geschaffen. Der chemische Vesikulationsprozess wurde mit der Durchflusszytometrie und den Fluoreszenzbildgebungsverfahren untersucht. Die Fusion der Schichten wurde mit der Quarzkristall-Mikrowaage in einem Mikrofluidsystem überprüft. Zwei Zellkulturmodelle wurden verwendet, um ihre Wechselwirkungen mit den biomimetischen Schichten zu charakterisieren: HL-1, eine kardiomyozytenähnliche Zelllinie und primäre kortikale Neuronen aus E18 Embryonen der Ratte. Diese Zellen haben deutlich unterschiedliche Eigenschaften und Anforderungen an ihre Umgebung, so dass jeweils unterschiedliche Charakterisierungswege ausgewählt wurden. Für HL-1-Zellen, die im Wesentlichen Muskelzellen sind, wurde ihr Zytoskelett überwacht. Die Fähigkeit, ein entwickeltes Zytoskelett zu bilden, das die Zellform und Kontraktionenunterstützt, hängt von der Stärke ihrer Wechselwirkung mit dem Substrat und seiner Weichheit ab. Mit der Modifizierung der biochemischen Schichten durch Hinzufügen unterschiedlich Mengen an Zellextrakten gelang es, die optimalen Bedingungen für die Zelladhäsion einzustellen. Diese Ergebnisse wurden in [3] veröffentlicht. Für neuronale Zellen in vitro ist die Entwicklung der Zellpolarität die Haupteigenschaft. Die Dynamik der Neuritenverlängerung auf verschiedenen Beschichtungen wurde analysiert und es konnte gezeigt werden, dass Wechselwirkungen von Neuronen mit hochflüssigen SLB-basierten Beschichtungen in den ersten Stunden der Entwicklung einzigartige Merkmale aufweisen.

Ability to study living cells by a non-invasive methods, such as cell culture, was a foundation for modern biological and biotechnological advances. As it was discovered that a cell function cannot be separated from its surroundings, a quest to recreate living tissues in controlled laboratory conditions began. The researchers are constantly trying to impove methodology to study cells in environments that resemble natural tissue environments the most. The creation of complex environments requires precise controll of properties of the underlying substrate. The project consisted of the development of the coating that mimics a natural cell membrane and is a suitable platform for cell culture, and the adaptation of the electrical measurement system. Solid-supported lipid bilayers (SLBs) were used as the basis for the biomimetic coatings, and graphene field-effect transistors (GFETs) as the measurement system. The major challenge of the first part of the project was to overcome hydrophobicity of graphene surface, as lipid bilayers are not formed on the pristine graphene. An electrochemical oxidation was tested as a route to overcome that. However, it was revealed that chemical vapor deposited (CVD) graphene is incompatible with this method, as the process, instead of the uniform functionalization, destructed the layer integrity. Moving along with the theme of a link between electrochemical properties and the surface quality, the detailed research on the origins of the leakage currents of graphene electrolyte-gated transistors was performed. It was determined that value can be used to evaluate and monitor surface properties of graphene in situ. Results of these findings were summarized in publications [1, 2].To produce biomimetic coatings, extracts from cell membranes of HEK293 cells were made by the chemical vesiculation method. Similarity of the structural backbone of cell vesicles and SLBs made from artificial lipid mixes allows them to fuse into composite layers that are enriched by cell membrane molecules, such as glycolipids and proteins, that are important for cell-cell interactions. The chemical vesiculation process was studied with the flow cytometry and the fluorescent imaging methods, and fusion of layers – by the quartz crystal microbalance in a microfluidic system. Two cell culture models were used to characterize their interactions with the biomimetic layers: HL-1, the cardiomyocyte-like cell line, and primary cortical neurons from rat embryo brains. These cells have distinctly different properties and demands to their environment, so different characterization pathways were selected for each. For HL-1 cells, which are, essentially, muscle cells, their cytoskeleton was monitored. The ability to form a developed cytoskeleton that supports the cell shape and contractions depends on the strength of their interaction with the substrate and its softness. Biomimetic coatings modified with different amounts of cell extracts allowed to tune the optimal conditions for cell adhesion. These findings were published in [3].For neuronal cells in vitro the development of the cell polarity is their main property. The neurite elongation dynamics on different coatings were analyzed and it was discovered that interactions of neurons with highly fluid SLB-based coatings have unique features during the earliest hours of the development.

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