Experimental approaches to mapping the binding site of RFamides on the peptide-gated Hydra magnipapillata sodium channels (HyNaCs)

Bachmann, Michèle; Spehr, Marc; Gründer, Stefan

doi:41640

Experimental approaches to mapping the binding site of RFamides on the peptide-gated Hydra magnipapillata sodium channels (HyNaCs)

Bachmann, Michèle^RWTH*

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michèle Bachmann (Master of Science)

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Spehr, Marc (Thesis advisor)^RWTH* ; Gründer, Stefan (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-08-17

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-08750
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/853303/files/853303.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
cnidaria (frei) ; hydra (frei) ; ion channel (frei) ; ligand (frei) ; neuropeptide (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ionenkanäle der DEG/ENaC Genfamilie sind in einer verblüffenden Vielfalt physiologischer Prozesse involviert. Sie werden charakterisiert durch spannungsunabhängiges „Gating“, Permeabilität für Na+ und Blockierung durch Amilorid. Neben mechanischer Stimulation aktivieren verschiedene Substanzen wie Protonen und kleine Peptidliganden einige DEG/ENaCs, während andere konstitutiv offene Kanäle bilden. Lange wurde angenommen, dass Neuropeptide nur als Liganden bei relativ langsamer metabotroper Transmission via G- Protein gekoppelter Rezeptoren dienen. Die Entdeckung der FMRFamid-aktivierten Na+- Kanäle (FaNaCs) in der Schnecke Helix aspersa, somit ein Liganden-aktivierter DEG/ENaC Kanal, verursachte eine Neuorientierung dieser traditionellen Sichtweise. Nachfolgend wurde entdeckt, dass Hydra magnipapillata Na+-Kanäle (HyNaCs) ebenfalls von kleinen endogenen Neuropeptiden namens RFamiden aktiviert werden. Die Bindestelle von RFamid I und II an HyNaCs ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurde das HyNaC2/5/3 Heterotrimer zusammen mit RFamid II verwendet. Zuerst wurden die HyNaC Untereinheiten für heterologe Expression in Säugetierzellen Codon- optimiert. Durch das Anpassen der nativen HyNaC Gensequenz an die Codonpräferenz von Homo sapiens konnten wir die Gesamtproteinexpression und den durch RFamid-Bindung an HyNaCs erzeugten Strom in HEK293 T Zellen stark erhöhen. Die unbekannte Stöchiometrie der HyNaC Untereinheiten im Heterotrimer wurde durch Photo-Crosslinking mithilfe einer unnatürlichen Aminosäure enthüllt und zeigte eine strikte 2-5-3 Stöchiometrie. Protein- Liganden Docking wurde durchgeführt, um potenzielle Bindestellen für RFamid II am Heterotrimer vorherzusagen. Aminosäuren, die hierbei als Kandidaten für die Bindestelle an der Daumen-Domäne von HyNaC3 auffielen, wurden basierend auf vorherigen funktionellen Ergebnissen des Gründer-Labors ausgesucht und wurden für UV-induziertes Photo- Crosslinking verwendet. Mithilfe verschiedener Antikörper wie α-FMRFamid, α-RFamid, und einem affinitätsaufgereinigten α-RFamide II Antikörper, welche erfolgreiches Crosslinking über den Peptidliganden nachweisen sollten, konnten wir kein spezifisches Signal nachweisen, welches auf kovalent gebundene RFamid-HyNaC-Komplexe hindeutete. Modifizierung von RFamid II mit Biotin oder einem flag-tag an verschiedenen Aminosäurepositionen erzeugte stark verringerte apparente Affinität, weshalb wir nachfolgend einen Alanin-Scan des Peptids durchführten. Der Scan zeigte eine starke Verringerung der apparenten Affinität für jede Aminosäure des Peptids, außer für Position 5 (Glyzin). Photo-crosslinking mithilfe von biotinylierten Peptiden führte ebenfalls zu keinem spezifisch detektierbaren Crosslinking-Signal auf Western Blots. Schließlich nutzten wir den affinitätsaufgereinigten α-RFamide II Antikörper mit einer RFamid II Variante, welche ein N- terminales Cystein statt des Pyroglutamats trug und für die Kopplung an einen Carrier während der Antikörpersynthese genutzt wurde. Auch hier war die Visualisierung eines RFamid II-HyNaC-Komplexes auf einem Western Blot nicht möglich. Die Identifikation der Bindestelle von RFamiden an HyNaCs könnte dazu beitragen, das Grundverständnis phylogenetischer und evolutionärer Verwandtschaft zwischen DEG/ENaC Proteinen zu vertiefen und weiterhin dabei helfen, diese Erkenntnisse von einfachen Nervensystemen auf konservierte Merkmale ebensolcher Kanäle in komplexeren Tieren zu übertragen. Zukünftige Experimente werden das radioaktive Labelling von RFamid II nutzen, um weitere Einsicht in eine mögliche Bindestelle des Liganden an der Daumendomäne von HyNaC3 zu gewinnen.

Ion channels of the DEG/ENaC family are involved in a stunning variety of physiological processes. They are characterized by voltage-independent gating, permeability to Na+ and blockage by amiloride. Aside from mechanically stimulated or constitutively open channels, various compounds such as protons and small peptides mediate DEG/ENaC gating. Neuropeptides were long assumed to only serve as ligands in relatively slow metabolic transmission via G-protein coupled receptors. The discovery of FMRFamide-gated sodium channels (FaNaCs) in the snail Helix aspersa, a type of DEG/ENaC activated by FMRFamides, prompted a reorientation of this traditional view. Later, Hydra magnipapillata sodium channels (HyNaCs) were discovered to also be activated by small endogenous neuropeptides called Hydra RFamides. The binding site of RFamide I and II on HyNaCs remains unknown and was explored in this work. For this, the HyNaC2/5/3 heterotrimer in combination with RFamide II was utilized. First, the HyNaC subunits were codon-optimized for heterologous expression in mammalian cells. By changing the native HyNaC gene sequence to codons following the preference of Homo sapiens, we strongly increased total protein expression and current evoked by RFamides on HyNaCs in HEK293 T cells. The unknown stoichiometry of HyNaC subunits in a heterotrimer was elucidated using photo-crosslinking via an unnatural amino acid and revealed an obligate stoichiometry of 2-5-3 in a clockwise orientation. Protein-ligand docking was performed to explore potential binding sites for RFamide II on the heterotrimer. Candidate residues on the thumb domain of HyNaC3 were chosen based on preliminary functional results by the Gründer lab and were used for UV-induced photo-crosslinking. Utilizing various antibodies such as α-FMRFamide, α-RFamide, and purified custom α-RFamide II to detect successful crosslinking via the peptide ligand, we were unable to find a specific signal indicating covalent RFamide-HyNaC complexes. Modification of RFamide II with biotin or a flag-tag at various positions resulted in strongly decreased apparent affinity, after which an alanine scan of the peptide was performed. The scan revealed a strong decrease in binding affinity of RFamide II for every residue except one, position 5 (glycine). Photo-crosslinking using biotinylated peptides also resulted in no specific crosslinking signal on western blot. Lastly, using the purified α-RFamide II antibody in combination with an RFamide II variant that carried an N-terminal cysteine instead of pyroglutamate, which was used for coupling to a carrier during antibody synthesis, did not manage to visualize RFamide II-HyNaC complexes on a western blot. Research elucidating the location of the RFamide binding site on HyNaCs promises to increase understanding of phylogenetic and evolutionary relations between DEG/ENaC family members and help extrapolate results from simpler nervous systems to conserved features in higher animals. Future research using radioactive labelling of RFamide II could lead to insight into the putative binding site on the thumb domain of HyNaC3.

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