Study of inflammatory-related miRNAs after acute CNS injuries

Voelz, Clara Viola; Beyer, Cordian; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion

doi:10.18154/RWTH-2022-09369

Study of inflammatory-related miRNAs after acute CNS injuries

Voelz, Clara Viola^RWTH*

2022

VerantwortlichkeitsangabeClara Viola Voelz, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)^RWTH* ; Beyer, Cordian (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-09-29

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-09369
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/854164/files/854164.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
hypoxic stimulation (frei) ; ischemic stroke (frei) ; miRNA (frei) ; miRNA biosynthesis (frei) ; spinal cord injury (frei) ; stress granules (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Akute Verletzungen des zentralen Nervensystems (ZNS) führen zu einem irreversiblen Zelltod, der zu lebenslangen Behinderungen oder zum Tod führen kann. Akute ZNS-Verletzungen können infolge eines verschlossenen Blutgefäßes, wie beim ischämischen Schlaganfall (IS), oder aufgrund eines akuten Traumas, z.B. bei Rückenmarksverletzungen (SCI, spinal cord injury), auftreten. Die Schädigung ist nicht nur auf das Verletzungsgebiet beschränkt, sondern findet auf systemischer Ebene statt. Infolgedessen wurde die Deregulierung einer großen Zahl von Genen beschrieben, darunter so genannter microRNAs (miRNA). miRNAs sind nicht-kodierende RNAs, die komplementär an mRNA-Stränge binden können, um den Translationsprozess zu hemmen. Nach akuten ZNS-Verletzungen wurde eine Veränderung der miRNA-Level am Ort der Verletzung beschrieben. In dieser Studie wurde untersucht, ob die Auswirkungen auf das ZNS auch zu veränderten miRNA-Level auf systemischer Ebene führen. Experimentell wurden in vivo ein ischemischer Infarkt bei Ratten und eine Rückenmarksverletzung in Mäusen durchgeführt. Der Infarkt wurde durch einen Verschluss der Arteria cerebri media (tMCAo, transient middle cerebral artery occlusion) ausgelöst, die für 1 h mit einem Filamentfaden verschlossen wurde. Bei Mäusen wurde durch eine Quetschung der Brustwirbelsäule eine Lähmung der Hintergliedmaßen ausgelöst. Nach 6, 12, 24 und 72 h wurden die Tiere getötet und Blut- und Gewebeproben entnommen. In vitro wurde eine hypoxische Stimulation menschlicher Mikrogliazellen (HMC-3 Zelllinie) durchgeführt. Nach der tMCAo wurde ein Affymetrix-Array durchgeführt. Daraufhin wurden vier miRNAs ausgewählt (miR-223-3p, miR-155-5p, miR-448-5p und miR-3473), um detailliertere Messungen in verschiedenen Gehirn- und Körperregionen durchzuführen. Da die miRNAs nicht in allen verwendeten Organismen nachweisbar waren, wurde im SCI Modell miR-3473 durch miR-124-3p ersetzt. Das Expressionsniveau der miRNAs wurde mit qRT-PCR in verschiedenen Gehirn- und Körperregionen gemessen, um die Bandbreite der miRNA-Veränderungen zu beobachten. Im tMCAo-Modell wurde eine Veränderung der miRNAs insbesondere in der Großhirnrinde und in der Amygdala beobachtet. Bei miR-223-3p und miR-448 waren die Veränderungen auch in der kontralateralen Gehirnhälfte sichtbar. Im Blutserum wurde ein Anstieg von miR-223-3p nach 6 h beobachtet, während miR-155-5p und miR-3473 zu allen Zeitpunkten herunterreguliert wurden. Im SCI-Modell waren die Veränderungen weniger stark ausgeprägt. Im Bereich der Verletzung stieg die Expression von miR-223-3p und miR-155-5p nach 72 h an. Auch in den rostralen und kaudalen Teilen des Rückenmarks und im Blutserum waren Veränderungen für miR-223-3p, miR-155-5p und miR 124-3p sichtbar. In den peripheren Organen wurde nach 12 h nur eine geringe Herabregulierung für miR-155-5p beobachtet. Ebenfalls wiesen entzündungsbezogene mRNAs wie Nlrp3, Socs1, Socs3 und Vegfa nach tMCAo in allen Gehirn- und Körperregionen eine Hochregulierungen auf, was darauf hindeutet, dass die systemischen Veränderungen mit Reaktionen des Immunsystems zusammenhängen könnten. miRNAs durchlaufen einen mehrstufigen Reifungsprozess, bevor sie in der Lage sind, translationales Silencing zu betreiben. Nach tMCAo und SCI konnten keine Veränderungen in der Genexpression der beteiligten Moleküle (Drosha, Dgcr8, Xpo5, Dicer, Tarbp2, Ago2) beobachtet werden. Nach In vitro Hypoxie wurde jedoch ein Anstieg der Enzyme DROSHA, DICER und AGO2 auf Gen- und Proteinebene festgestellt. Außerdem wurde eine Kolokalisierung von AGO2 und G3BP, einem Marker für Stressgranula, festgestellt. Zukünftige Studien sollten sich also nicht nur auf die miRNA-Target-Interaktion im zerebralen Kortex und im thorakalen Rückenmark konzentrieren, sondern ihre Forschung auf den Hintergrund der miRNA-Transport-/Deregulationsprozesse und den Einfluss auf Prozesse wie die systemische Aktivierung des Immunsystems ausweiten.

Acute central nervous system (CNS) injuries lead to irreversible cell death, leaving patients with life-long disabilities or death. Acute CNS injuries can occur due to an occluded blood vessel as observed in cases of ischemic stroke (IS) or due to a traumatic impact, as is often the case in spinal cord injuries (SCI). The resulting damage is not limited to the area of injury, but occurs at a systemic level. As a result, the deregulation of a high number of genes has been described, among them: microRNAs (miRNAs). miRNAs are non-coding RNAs that bind to complementary mRNA strands and inhibit the translational process. At the injury site, an alteration of miRNA levels has been described following acute CNS injuries. This thesis seeks to investigate wheter the impact to the CNS also triggers altere miRNA levels on a systemic level. In pursuit of this, I used two different experimental set-ups of experimental middle cerebral artery occlusion (tMCAo) in rats, and spinal cord injury (SCI) in mice for in vivo studies. By insertion of a filament to the middle cerebral artery for 1 h, tMCAo was performed. To replicate a contusion of the thoracal spine, paralysis of the hindlimbs was initiated in mice. After 6, 12, 24, and 72 h, the animals were sacrified, with blood and tissue samples being collected. A third approach was hypoxic stimulation of human microglia cells (HMC-3 cell line) in vitro. Following tMCAo, an affymetrix array was conducted to assess the miRNA alterations in the cerebral cortex. Subsequently, miR-223-3p, miR-155-5p, miR-448-5p, and miR-3473 were chosen for closer examination in different brain and body parts. In cases of SCI miR-3473 was replaced with miR-124-3p, due to the former being undetectable. Expression levels of the miRNAs were measured via qRT-PCR in different brain and body parts to observe the range of miRNA alterations. Following tMCAo, an alteration of miRNAs was observed especially in the cerebral cortex at all time points and additionally in the amygdala. In cases of miR-223-3p and miR-448-5p, the alterations were also visible at the contralateral brain hemisphere. In the blood serum, an increase of miR-223-3p at 6 h was observed, whilst miR-155-5p, and miR-3473 were downregulated at all time points. Following SCI, the alterations were less pronounced. At the injury site, miR-223-3p, and miR-155-5p increased after 72 h. Also, alterations in the rostral and caudal parts of the spinal cord and the blood serum where detectable for miR-223-3p, miR-155-5p, and miR-124-3p. In peripheral organs, only a small downregulation for miR-155-5p was observed at 12 h. Not only miRNAs displayed a systemic alteration, additionally inflammation-related mRNAs such as Nlrp3, Socs1, Socs3 and Vegfa displayed upregulations in all brain and body regions following tMCAo, suggesting that the systemic alterations could be connected to immune responses. The miRNAs pass through a multistep maturation process before they can perform translational silencing. Following tMCAo and SCI, no alterations in the gene expression of involved molecules (Drosha, Dgcr8, Xpo5, Dicer, Tarbp2, Ago2) could be observed. But following in vitro hypoxia, an increase of the enzymes DROSHA, DICER, and AGO2 was found on both, transcriptional and translational levels. Additionally, a co-localization of AGO2 and G3BP, a marker for stress granules, was detected. To conclude, future studies, seeking to expand on this work should not only focus on miRNA target interaction in the cerebral cortex and the thoracal spinal cord but widen their research to the background of miRNA transportation/deregulation processes and the influence on processes like the systemic activation of the immune system.

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