Accelerated production and screening of catalytically active inclusion body libraries via automated workflows

Küsters, Kira; Wiechert, Wolfgang; Schwaneberg, Ulrich; Oldiges, Marco

doi:HT021622165

Accelerated production and screening of catalytically active inclusion body libraries via automated workflows

Küsters, Kira^RWTH*

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kira Küsters Master of Science (M.Sc.)

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Oldiges, Marco (Thesis advisor)^RWTH* ; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH* ; Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-11-09

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-10289
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/855590/files/855590.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In den letzten Jahren wurde die Produktion von inclusion bodies nachgewiesen, die eine erhebliche katalytische Aktivität aufweisen. Diese katalytisch aktiven inclusion bodies (CatIBs) wurden durch genetische Fusion eines aggregationsinduzierenden Tags mit dem gewünschten Gen über kurze Linker-Polypeptide und anschließender Überproduktion der resultierenden Genfusion in Escherichia coli gebildet. Die resultierenden CatIBs sind bekannt für ihre einfache und kostengünstige Produktion, ihre Wiederverwertbarkeit sowie ihre hohe Stabilität und stellen eine Alternative als rein biologische Technologie für die Enzymimmobilisierung dar. Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Selbstaggregation in einer trägerfreien, biologisch abbaubaren Form sind keine weiteren aufwendigen Immobilisierungsschritte oder zusätzliche Materialien erforderlich. Diese positiven Eigenschaften verschaffen CatIBs eine vorteilhafte Position im Vergleich zu herkömmlichen Immobilisierungstechniken. Jüngste Studien haben die Auswirkungen der kooperativen Effekte des Linkers und des aggregationsauslösenden Tags auf das Aktivitätsniveau von CatIBs gezeigt. Es ist bisher jedoch nicht möglich, eine Vorhersage über die beste Kombination von Linker und aggregationsauslösendem Tag zu treffen. Daher müssen viele Varianten getestet werden, um die besten CatIBs zu finden. Dafür muss die ganze CatIB-Prozessierung, von der Konstruktion bis zur Analyse, beschleunigt werden, um ein schnelles Screening von CatIB Bibliotheken zu ermöglichen. In einer Proof-of-Concept-Studie wurde eine Reihe von Lysindecarboxylase-CatIBs aus E. coli (EcLDCc) mittels Golden Gate Assembly generiert und mit einem optimierten Aufreinigungsprotokoll verarbeitet, das im späteren Verlauf eine Automatisierung des Prozesses ermöglicht. Insgesamt wurden zehn EcLDCc-Varianten generiert, die aus Kombinationen von zwei Linker- und fünf aggregationsinduzierenden Tag-Sequenzen bestehen. Ein flexibler Serin/Glycin (SG)- sowie ein starrer Prolin/Threonin (PT)-Linker wurden in Kombination mit den Peptiden (18AWT, L6KD und GFIL8) oder den Coiled-Coil-Domänen (TDoT und 3HAMP) als aggregationsinduzierende Tags getestet. Interessanterweise zeigten die meisten Kombinationen mit dem starren PT-Linker die höchsten Aktivitäten. EcLDCc-PT-L6KD wurde als die beste Varianten identifiziert, die eine spezifische volumetrische Produktivität von 256 gDAP L-1 d-1 gCatIB 1 ermöglicht. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mikroskopische Analyse als Werkzeug zum Auffinden von CatIB-produzierenden Stämmen dienen kann und somit ein Vorscreening in einem frühen Stadium ermöglicht, um Zeit und Ressourcen zu sparen. Um den Mikroskopieprozess zu beschleunigen, wurde ein automatisierter Mikroskopie-Workflow implementiert und zur Beobachtung der CatIB-Bildung eingesetzt. Die sowohl manuell als auch automatisiert ausgewerteten Ergebnisse zeigten, dass die Bildung der CatIBs nach 27 Stunden einsetzte. Nach der Proof-of-Concept-Studie mit dem EcLDCc wurde ein semi-automatischer Klonierungs-Workflow implementiert, um eine schnelle Konstruktion von CatIB-Bibliotheken mit einer Zeitersparnis von 83 % zu ermöglichen, so dass nur 11 Stunden manuelle Arbeit für die Konstruktion von 96 CatIB-Varianten erforderlich waren. Der Klonierungs-Workflow wurde verwendet, um 14 CgAHAS (Acetolactat-Synthase von Corynebacterium glutamicum)-, 60 LbADH (Alkohol-Dehydrogenase von Lactobacillus brevis)-, 63 BsGDH (Glucose-Dehydrogenase von Bacillus subtilis)- und 30 BmMO (Monooxygenase von Bacillus megaterium)-CatIB-Variantenbibliotheken erfolgreich zu erzeugen. Um die konstruierten CatIB-Varianten parallel zu testen, war eine Beschleunigung der manuellen CatIB-Analyse erforderlich. Daher wurde eine Miniaturisierung der Kultivierung und der CatIB-Aufreinigung von einem 10 mL Schüttelkolben auf einen 1 mL FlowerPlate® Maßstab angewendet. Außerdem wurde der enzymatische Assay in einer Mikrotiterplatte (250 µL) anstelle von Reaktionsgefäßen (1 mL) durchgeführt. Der beschleunigte Arbeitsablauf wurde für das Screening der CgAHAS- und LbADH-CatIB-Bibliotheken verwendet, wobei 2 von 14 (CgAHAS) und 8 von 60 (LbADH) erfolgreiche CatIB-Kandidaten gefunden wurden. Nach der Prozessbeschleunigung bestand der nächste Schritt darin, den CatIB-Screening-Workflow zu automatisieren. Der erste Schritt war die Implementierung eines robusten manuellen Arbeitsablaufs, der anschließend auf eine Roboterplattform übertragen wurde. Dafür wurden 14 C-terminal angehängte BsGDH-Varianten generiert und in einem manuellen Ansatz analysiert. Ähnlich wie in der EcLDC-Studie wurden SG- oder PT-Linker mit einem von acht aggregationsinduzierenden Tags kombiniert. Neben den fünf getesteten aggregationsinduzierenden Tags, 18AWT, L6KD, GFIL8, TDoT und 3HAMP, wurde zusätzlich der Einfluss von ELK16, TorA und CBDCell auf die CatIB-Aktivität analysiert. Der enzymatische Assay zeigte, dass die höchsten Umsätze wieder mit PT-Linker-Varianten erreicht wurden. Die vielversprechendste Variante war BsGDH-PT-CBDCell mit einer spezifischen volumetrischen Produktivität von 55,8 gNADH L-1 d-1 gCatIB-1. Diese Variante wurde zudem genauer charakterisiert, einschließlich der Langzeitlagerung bei 20 °C sowie der NADH-Cofaktor-Regenerationsleistung in wiederholten Batch-Experimenten in Kombination mit CatIB-Recycling. Nach dem Einfrieren verloren BsGDH-PT-CBDCell CatIBs nach 8 Wochen Lagerung nur ca. 10 % ihrer Aktivität. Außerdem waren nach 11 CatIB-Recyclingzyklen im repetitiven Batch-Betrieb noch 80 % der Aktivität vorhanden. Mit den BsGDH-CatIBs wurde nicht nur das NADH-Recycling analysiert, sondern auch das NADPH-Recycling. BmMO-CatIBs als NADPH-Verbraucher wurden konstruiert und zum Nachweis der NADPH-Recyclingfähigkeit von BsGDH verwendet. 13 von 30 BmMO-CatIBs zeigten Aktivität in Kombination mit NADPH-Recycling. Nach der Durchführung des manuellen Screenings wurde BsGDH-PT-CBDCell zur Implementierung, Optimierung und Validierung des automatisierten CatIB-Screening-Workflows verwendet, um die Analyse mehrerer CatIB-Kandidaten zu verbessern. Wichtige Optimierungsschritte waren z.B. der Ausschluss eines Positionseffekts im BioLector® durch Erhöhung der Kultivierungstemperatur auf 25 °C und die Sicherstellung der Pipettierreproduzierbarkeit durch Verbesserung der Pipettiereinstellungen wie Geschwindigkeit, Mischen, Luftblasen und Höhe. Die Validierung des optimierten Arbeitsablaufs mit einer relativen Standardabweichung von 1,9 % ergab eine hohe Reproduzierbarkeit. Nach der Validierung wurde der Arbeitsablauf in Kombination mit dem Thompson Sampling als Entscheidungshilfe für die Stammauswahl durchgeführt, um 63 BsGDH-CatIB-Varianten zu analysieren. Es wurden drei Durchgänge mit jeweils 48 Kultivierungen parallel durchgeführt. Die Screenings zeigten, dass 24 von 63 BsGDH-CatIB-Varianten erfolgreich waren. Bereits in der ersten Screening-Runde erwies sich TDoT-PT-BsGDH als vielversprechender CatIB-Kandidat, so dass die Wahrscheinlichkeit hoch war, dass es sich um die beste BsGDH-CatIB-Performance handelt. Daher hat der Thompson-Sampling-Algorithmus diese Variante in 50 biologischen Replikaten während der drei Screening-Runden ausgewählt. Mit dem implementierten halbautomatischen CatIB-Konstruktions-, Aufreinigungs- und Screening-Workflow konnte die manuelle Arbeitszeit von 59 Stunden auf 7 Stunden für 48 Varianten (-88 %) reduziert werden. Zudem wurde eine Hochskalierung als Schüttelkolbenkultivierung der drei besten BsGDH-CatIB-Varianten als Validierungsstudie für das Thompson-Sampling durchgeführt, die sehr ähnliche Ergebnisse wie die FlowerPlate®-Kultivierung zeigte. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Thompson-Sampling für das BsGDH-Screening erfolgreich war. Obwohl die Analyse aller CatIB-Enzyme ergab, dass z. B. der PT-Linker im Vergleich zum SG-Linker mit größerer Wahrscheinlichkeit erfolgreiche CatIB-Varianten bildet, ist dennoch keine Vorhersage a priori möglich, da jedes Enzym andere Linker/Aggregations-induzierende Tag-Kombinationen für höchste Leistung benötigt. Daher ist die Verwendung des automatisierten Arbeitsablaufs ein wichtiges Werkzeug zur Verbesserung und Vereinfachung des Screenings, um den besten CatIB-Produzenten aus großen CatIB-Bibliotheken zu finden.

In recent years, the production of inclusion bodies that retained substantial catalytic activity was demonstrated. These catalytically active inclusion bodies (CatIBs) were formed by genetic fusion of an aggregation inducing tag to a gene of interest via short linker polypeptides and overproduction of the resulting gene fusion in Escherichia coli. The resulting CatIBs are known for their simple and cost efficient production, recyclability as well as high stability and provide an alternative, purely biological technology for enzyme immobilization. Due to their ability to self aggregate in a carrier-free, biodegradable form, no further laborious immobilization steps or additional reagents are needed. These advantages put CatIBs in a beneficial position in comparison to traditional immobilization techniques. Recent studies outlined the impact of cooperative effects of the linker and aggregation inducing tag on the activity level of CatIBs. However, no a priori prediction is possible to indicate the best linker/aggregation inducing tag combination. So, testing of many variations is required to find the best performing CatIB variant. Therefore, an accelerated CatIB processing is needed to allow a fast construction and screening of CatIB libraries. In a proof of concept study, a set of lysine decarboxylase CatIBs from E. coli (EcLDCc) were generated via Golden Gate Assembly and processed with an optimized purification protocol that would allow automation of the workflow in further processes. A total of ten EcLDCc variants consisting of combinations of two linker and five aggregation inducing tag sequences were generated. A flexible Serine/Glycine (SG)- as well as a rigid Proline/Threonine (PT)-Linker were tested in combination with artificial peptides (18AWT, L6KD and GFIL8) or coiled-coil domains (TDoT and 3HAMP) as aggregation inducing tags. Interestingly, most of the combinations with the rigid PT-Linker showed the highest conversions. EcLDCc-PT-L6KD was identified as the best of all variants allowing a specific volumetric productivity of 256 gDAP L 1 d 1 gCatIB-1. Furthermore, we demonstrated that microscopic analysis can serve as a tool to identify CatIB producing strains and thus allow for prescreening at an early stage to save time and resources. To accelerate the microscopy process, an automated microscopy workflow was implemented and used to observe the CatIB formation process. The automated and manual evaluated results showed that the CatIB formation started after 27 h. After the proof of concept study with the EcLDCc, a semi-automated cloning workflow was implemented to allow fast CatIB library construction with a time reduction of 83 %, resulting in only 11 h of manual work for the construction of 96 CatIB variants. The cloning workflow was used to generate 14 CgAHAS (acetolactate synthase of Corynebacterium glutamicum)-, 60 LbADH (alcohol dehydrogenase of Lactobacillus brevis)-, 63 BsGDH (glucose dehydrogenase of Bacillus subtilis)- and 30 BmMO (monooxygenase of Bacillus megaterium)-CatIB variants successfully. To test the constructed CatIB variants in parallel an acceleration of the manual CatIB analysis was needed. Therefore, a miniaturization of the cultivation and CatIB purification from a 10 mL shake flask scale to a 1 mL FlowerPlate® scale was realized. Furthermore, the enzymatic assay was performed in a microtiter plate (250 µL) instead of reaction tubes (1 mL). The accelerated workflow was used to screen the CgAHAS- and LbADH-CatIB libraries, which revealed 2 out of 14 (CgAHAS) and 8 out of 60 (LbADH) successful CatIB candidates. After process acceleration, the next step was to automate the CatIB screening workflow. The first step was to implement a robust manual workflow, which was transferred to a robotic platform subsequently. Therefore, 14 C-terminally tagged BsGDH variants were generated and analyzed in a manual approach. Similar as in the EcLDC study, SG- or PT-Linker were combined with one of eight aggregation inducing tags. Besides the five tested aggregation inducing tags, 18AWT, L6KD, GFIL8, TDoT and 3HAMP, the influence of ELK16, TorA and CBDCell on the CatIB activity were analyzed. The enzymatic assay showed that the highest conversions were again reached with PT-Linker variants. The most promising variant was BsGDH-PT-CBDCell with a specific volumetric productivity of 55.8 gNADH L 1 d 1 gCatIB-1. This variant was characterized in more detail including long-term storage at 20 °C as well as NADH cofactor regeneration performance in repetitive batch experiments with CatIB recycling. After freezing, BsGDH PT CBDCell CatIBs only lost approx. 10 % activity after 8 weeks of storage. Furthermore, after 11 CatIB recycling cycles in repetitive batch operation, 80 % of the activity was still present. Not only NADH recycling was analyzed with BsGDH-CatIB, but also NADPH recycling. BmMO-CatIBs as NADPH consumer were constructed and used to prove the NADPH recyclability of the BsGDH. 13 out of 30 BmMO-CatIBs revealed activity in combination with NADPH recycling. After realizing the manual screening, BsGDH-PT-CBDCell was used to implement, optimize and validate the automated CatIB screening workflow to enhance the analysis of several CatIB candidates. Important optimization steps were for example the exclusion of a position effect in the BioLector® by enhancing the cultivation temperature to 25 °C and the provision of pipetting reproducibility by improving pipetting settings like velocity, mixing, air gaps and height. The validation of the optimized workflow with a relative standard deviation of 1.9 % revealed a high reproducibility for the whole workflow. After validation, the workflow was performed in combination with Thompson sampling, as a decision tool for strain selection, to analyze 63 BsGDH-CatIB variants. Three rounds with 48 cultivations in parallel each were realized. The screening showed that 24 BsGDH-CatIB out of 63 were successful CatIB variants. Already in the first screening round TDoT-PT-BsGDH was a promising CatIB candidate, resulting in a high likelihood of being the best BsGDH-CatIB performer. Therefore, the Thompson sampling algorithm has selected this variant in 50 biological replicates during the three screening rounds. With the implemented semi-automated CatIB construction, processing and screening workflow the manual work time could be reduced from 59 h to 7 h for 48 variants (-88 %). Moreover, an upscaling as shake flask cultivations of the best three BsGDH-CatIB variants as a validation study for the Thompson sampling revealed similar results as compared to the FlowerPlate® cultivation. These results showed that the Thompson sampling was successful for the BsGDH screening. Although the analysis of all CatIB enzymes revealed that for example the PT-Linker was more likely to form successful CatIB variants compared to the SG-Linker, still no a priori prediction is possible, because every enzyme requires different linker/aggregation inducing tag combinations for highest performance. Therefore, using the automated workflow is an important tool to enhance and simplify the screening to find the best CatIB producer from large CatIB libraries.

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