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| 024 | 7 | _ | |a HT021627368 |2 HBZ |
| 024 | 7 | _ | |a 41786 |2 Laufende Nummer |
| 024 | 7 | _ | |a 10.18154/RWTH-2022-10395 |2 datacite_doi |
| 037 | _ | _ | |a RWTH-2022-10395 |
| 041 | _ | _ | |a German |
| 082 | _ | _ | |a 540 |
| 100 | 1 | _ | |0 P:(DE-588)127851421X |a Eiden, Sophia Charlotte |b 0 |u rwth |
| 245 | _ | _ | |a Charakterisierung der Bindung humaner Proteine an G-Quadruplex-DNA und -RNA |c vorgelegt von Sophia Charlotte Eiden (M.Sc.) |h online |
| 246 | _ | 3 | |a Binding characterization of human proteins to G-quadruplex DNA and RNA |y English |
| 260 | _ | _ | |a Aachen |b RWTH Aachen University |c 2022 |
| 300 | _ | _ | |a 1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme |
| 336 | 7 | _ | |0 2 |2 EndNote |a Thesis |
| 336 | 7 | _ | |0 PUB:(DE-HGF)11 |2 PUB:(DE-HGF) |a Dissertation / PhD Thesis |b phd |m phd |
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| 336 | 7 | _ | |2 ORCID |a DISSERTATION |
| 500 | _ | _ | |a Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University |
| 502 | _ | _ | |a Dissertation, RWTH Aachen University, 2022 |b Dissertation |c RWTH Aachen University |d 2022 |g Fak01 |o 2022-11-04 |
| 520 | 3 | _ | |a Das in dieser Arbeit vorgestellte Promotionsprojekt widmete sich der Charakterisierung der Bindungseigenschaften nuklearer Proteine in Bezug auf sogenannte G-Quadruplex-Nukleinsäurestrukturen. Bei der G-Quadruplex handelt es sich um eine besondere Sekundärstruktur von Nukleinsäuren, bei der sich vier Guaninmoleküle innerhalb einer Sequenz zu einer planaren Tetrade zusammenfinden. Durch Kombination unterschiedlicher Anzahlen solcher G-Tetraden entstehen verschiedene Formen dieser ungewöhnlichen Sekundärstruktur. Die Bindung der Proteine wurde sowohl in Hinblick auf G-Quadruplexstrukturen (Myc22-DNA, Myc22-RNA, CEB25-L111, CEB25-L191) als auch auf Nicht-G-Quadruplex-Strukturen (Guanin-reiche ssDNA und dsDNA) analysiert. Hierbei wurde sowohl auf das Desoxyribooligonukleotid als auch das Ribooligonukleotid der bereits bei Rauser (Valerie Rauser, Dissertation RWTH, 2019) eingesetzten Myc22-Sequenz zurückgegriffen. Analog zu der bei Rauser beschriebenen Methode zur Erzeugung monomerer Strukturen der G-Quadruplex (G4) Pu27- bzw. Myc22-DNA unter basischen Bedingungen wurde zu Beginn des Projektes zunächst eine Methode zur Erzeugung monomerer Myc22-RNA-Strukturen etabliert. Der Erfolg des jeweiligen Behandlungsansatzes wurde durch analytische Methoden wie Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography, SEC) und Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) verifiziert. Die vorbehandelten und zu monomeren G4-Strukturen gefalteten Oligonukleotide wurden im Anschluss für Bindungsstudien mit bestimmten vorwiegend nukleären Proteinen eingesetzt. Ausgegangen wurde hierbei von Proteinen, die im Jahr 2019 durch Rauser über proteomische Analysen von Eierstockskrebszelllysaten als vielversprechende G4-Bindungskandidaten identifiziert werden konnten. Als Vorarbeit für diese Bindungsstudien wurden zunächst einige der potentiell G4-bindenden Proteine (EED, hnRNPU und YBX1) jeweils mit einem His-Tag in E. coli-Zellen überexprimiert und mit Hilfe der Affinitätschromatographie (Nickel-NTA-Säule) und der Gelfiltration gereinigt. Die Charakterisierung der Protein-Bindungseigenschaften an die diversen DNA- bzw. RNA-Strukturen wurde mittels biochemischer wie biophysikalischer Methoden durchgeführt, um eine möglichst genaue Verifikation der Resultate zu ermöglichen. Als biochemische Methoden wurden der Pulldown-Assay sowie der EMSA (electrophoretic mobility shift assay) angewendet. Bei dem Pulldown-Assay handelt es sich um eine Art affinitätschromatographische Isolierungsmethode, bei der Proteine durch ihre Bindung an Oligonukleotid-beschichtete Magnetpartikel immobilisiert werden können. Die während der Bindungsreaktion entstandenen Protein-DNA-Komplexe können nach wiederholtem Waschen der Proben mit einer Natriumdodecylsulfat-Lösung (sodium dodecyl sulfate, SDS) dissoziiert und die festgesetzten Proteine durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) identifiziert und quantifiziert werden. Beim EMSA wird zunächst eine Bindungsreaktion mit Protein und Fluorophor-markiertem (Cy5) Oligonukleotid angesetzt und inkubiert. Der gesamte Bindungsansatz wird dann auf ein natives Polyacrylamid-Gel aufgetragen, bei dessen Auswertung sich typischerweise der namensgebende shift der Oligonukleotid-Banden im Vergleich zu den G4-Protein-Komplex-Banden erkennen lässt. Als biophysikalische Methoden kamen der FID-Assay (fluorescent intercalator displacement assay, FIDA) und die MST (Mikroskalige Thermophorese) zum Einsatz. Für den FIDA wird zunächst das unmodifizierte Oligonukleotid mit einem Fluorophor (hier Acridinorange bzw. Thiazol-Orange) inkubiert und dieser Ansatz dann schrittweise mit zunehmenden Konzentrationen an Protein titriert. Hierbei wird die sukzessive Fluoreszenzabnahme durch die Verdrängung (displacement) des Fluorophors durch das zugegebene Protein erfasst. Die mikroskalige Thermophorese basiert prinzipiell ebenso auf der Titration eines hier Cy5-modifizierten Oligonukleotids konstanter Konzentration mit unterschiedlichen Proteinkonzentrationen. Die Auswertung erfolgt durch Erfassung der Fluoreszenzänderung bzw. die Quantifizierung des gebildeten G4-Protein-Komplexes in Abhängigkeit von der eingesetzten Proteinkonzentration. Nach Durchführung der diversen Bindungsassays wurden die jeweiligen Resultate für jedes zu charakterisierende Protein analysiert, verglichen und auf die G4-Selektivität hin eingeordnet. Es zeigte sich dann abschließend, ob die potentiell G4-bindenden Proteine aus vorangegangenen proteomischen Analysen in der Tat G4-Binder sind oder sich möglicherweise doch Abweichungen ergeben. Hierbei konnte sich abschließend nur für einen Teil der untersuchten Proteine eine deutlich erkennbare G4-Selektivität erkennen lassen. Die übrigen Kandidaten zeigten teils eine erhöhte Guanin-Selektivität, teils eine gänzlich fehlende Selektivität gegenüber den eingesetzten Nukleinsäurestrukturen. |l ger |
| 520 | _ | _ | |a The doctoral project presented in this work was dedicated to the characterization of the binding properties of nuclear proteins in relation to so-called G-quadruplex nucleic acid structures. The G-quadruplex is a special secondary structure of nucleic acids in which four guanine molecules within a sequence come together to form a planar tetrad. Different numbers of such G-tetrads combine to form different types of this unusual secondary structure. The binding of the proteins was analyzed with regard to G-quadruplex structures (Myc22-DNA, Myc22-RNA, CEB25-L111, CEB25-L191) and non-G-quadruplex structures (guanine-rich ssDNA and dsDNA). Both the deoxyribooligonucleotide and the ribooligonucleotide of the Myc22 sequence already used by Rauser (Valerie Rauser, PhD thesis RWTH, 2019) were used here. Analogously to the method described by Rauser for generating monomeric structures of the G-quadruplex (G4) Pu27 DNA or Myc22 DNA under basic conditions, a method for generating monomeric Myc22 RNA structures was first established at the beginning of the project. The success of each treatment approach was verified by analytical methods such as size exclusion chromatography (SEC) and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The pretreated oligonucleotides, folded into monomeric G4 structures, were then used for binding studies with certain predominantly nuclear proteins - starting from proteins that were identified by Rauser in 2019 as promising G4 binding candidates through proteomic analyzes of ovarian cancer cell lysates. As preliminary work for these binding studies, some of the potential G4-binding proteins (EED, hnRNPU and YBX1), each equipped with a His tag, were overexpressed in E. coli cells and purified using affinity chromatography (Ni-NTA column) and gel filtration. The characterization of the protein binding properties to the various DNA and RNA structures was carried out using biochemical and biophysical methods in order to enable the most accurate possible verification of the results. The pulldown assay and the EMSA (electrophoretic mobility shift assay) were used as biochemical methods. The pulldown assay is a type of affinity chromatographic isolation method in which proteins can be immobilized by their binding to oligonucleotide-coated magnetic particles. The protein-DNA complexes formed during the binding reaction can be dissociated after repeated washing of the samples with a sodium dodecyl sulfate solution (sodium dodecyl sulfate, SDS) and the fixed proteins can be identified and quantified by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In EMSA, a binding reaction with protein and fluorophore-labeled (Cy5) oligonucleotide is set up and incubated. The entire binding mixture is then applied to a native polyacrylamide gel, which typically reveals the eponymous shift of the oligonucleotide bands compared to the G4-protein complex bands. The FID assay (fluorescent intercalator displacement assay, FIDA) and MST (microscale thermophoresis) were used as biophysical methods. For the FIDA, the unmodified oligonucleotide is first incubated with a fluorophore (here acridine orange or thiazole orange) and this mixture is then gradually titrated with increasing concentrations of protein. Here, the successive decrease in fluorescence due to the displacement of the fluorophore by the added protein is recorded. In principle, microscale thermophoresis is also based on the titration of a Cy5-modified oligonucleotide of constant concentration with different protein concentrations. The evaluation is carried out by detecting the change in fluorescence or by quantifying the G4-protein complex formed as a function of the protein concentration used. After carrying out the various binding assays, the respective results for each protein to be characterized were analyzed, compared and classified according to G4 selectivity. It then finally became apparent whether the potential G4-binding proteins from previous proteomic analyzes are in fact G4 binders or whether there are deviations. In the end, a clearly recognizable G4 selectivity could only be seen for some of the proteins examined. Some of the other candidates showed an increased guanine selectivity, some showed a complete lack of selectivity in relation to the nucleic acid structures used. |l eng |
| 588 | _ | _ | |a Dataset connected to Lobid/HBZ |
| 591 | _ | _ | |a Germany |
| 700 | 1 | _ | |0 P:(DE-82)005740 |a Weinhold, Elmar |b 1 |e Thesis advisor |u rwth |
| 700 | 1 | _ | |0 P:(DE-82)IDM03238 |a Albrecht, Markus |b 2 |e Thesis advisor |u rwth |
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