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Bioprocess development and optimisation for 5-ketofructose production with gluconobacter oxydans at different scales = Entwicklung und Optimierung von Bioprozessen zur Herstellung von 5-Ketofructose mit Gluconobacter oxydans in verschiedenen Maßstäben
2022 & 2023
Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2022
Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2023
Genehmigende Fakultät
Fak04
Hauptberichter/Gutachter
;
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-11-25
Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-11432
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/860502/files/860502.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
5-Ketofructose (frei) ; Auxotrophie (frei) ; Fructosedehydrogenase (frei) ; chromosomale Integration (frei) ; extended batch fermentation (frei) ; fructose dehydrogenase (frei) ; gluconobacter oxydans (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620
Kurzfassung
5-Keto-D-Fructose (5KF) ist ein vielversprechender natürlicher Süßstoff ohne Nährwert. Basierend auf dem zuvor entwickelten 5KF-Produktionsprozess mit G. oxydans wurde die 5KF Produktion hinsichtlich Titer, Ausbeute und Produktivität optimiert. Der 5KF-Titer wurde auf 545 g/L erhöht durch Fütterung einer Fructoselösung von 1200 g/L. Durch das Zufüttern von Fructose in Form von Würfeln konnte die höchste Produktivität von über 10 g5KF/L/h erreicht werde. Darüber hinaus wurde das Scale-up der 5KF-Produktion auf einen 150 L-Druckferment erfolgreich demonstriert. Synthetische Medien werden für die Fermentation im industriellen Maßstab bevorzugt. Daher wurde ein definiertes Minimalmedium für die 5KF-Produktion entwickelt. Ein reichhaltiges, definiertes Medium, bestehend aus 45 Komponenten, diente als Grundlage für die Entwicklung. Durch einen systematischen Ansatz wurde ein definiertes Minimalmedium, das so genannte "Gluconobacter-Minimalmedium", entwickelt, welches unter anderem die Aminosäuren Isoleucin, Glutamat und Glycin sowie die Vitamine Nikotinsäure, Pantothensäure und p-Aminobenzoesäure enthält. Im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Medien für Gluconobacter wurden ähnliche Ergebnisse in Bezug auf Kultivierungszeit, Titer und Produktivität erzielt. Für die plasmidfreie 5KF-Produktion, welche für Lebensmittelzusatzstoffe bevorzugt wird, wurde IK003.1::fdhSCL2 entwickelt. Die 5KF-Produktionsrate und -ausbeute waren deutlich höher als bei den Stämmen mit inzelintegration und näherten sich den Werten von IK003.1 mit plasmidbasierter fdhSCL-Expression an. Durch die zusätzliche plasmidbasierte Integration einer Invertase konnte Saccharose als erneuerbare und günstigere Kohlenstoffquelle genutzt werden. Die Verbesserung der Kultivierungsbedingungen führte zu einer Verkürzung der Kultivierungszeit um 40%, die Spaltung von Saccharose stieg um 36% und die OD600 stieg um das 2,5-fache. Um bereits in einem frühen Stadium der Prozessentwicklung wertvolle Informationen über die Profitabilität zu erhalten, wurde mit SuperPro Designer® ein Prozessmodell entwickelt und zur Bestimmung der effektivsten Prozessoptimierung verwendet. Die größte Auswirkung auf die 5KF-Produktion hatte das sogennante economy of scale. Durch die in dieser Arbeit durchgeführten Prozessoptimierungen konnten die Produktionskosten um 14% gesenkt werden. Die Produktionskosten könnten um weitere 20% gesenkt werden, wenn Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet würde.5-Keto-D-fructose (5KF) was recently identified as a promising non-nutritive natural sweetener. Based on previously reported 5KF production process with Gluconobacter oxydans, 5KF production was further increased regarding titre, yield, and productivity, as a cost efficient production process is key to being competitive. The 5KF titre was increased to 545 g/L by feeding a highly concentrated fructose solution of 1200 g/L. An alternative feeding strategy was presented using solid fructose cubes, reaching the highest productivity above 10 g5KF/L/h. Moreover, the scale-up of the 5KF production to a 150 L pressurised fermenter was successfully demonstrated using liquid fructose solution. Synthetic media are preferred for industrial-scale fermentation. Therefore, a defined minimal medium for production of 5KF with G. oxydans was developed. A rich, defined synthetic medium, consisting of 45 components was used as a basis for medium development. By applying a systematic approach, a defined minimal medium called "Gluconobacter minimal medium"was developed containing inter alia amino acids isoleucine, glutamate and glycine and the vitamins nicotinic acid, pantothenic acid and p-aminobenzoic acid. Compared to commonly used media for Gluconobacter, similar results regarding cultivation time, yield and productivity were obtained. Plasmid-free strains are preferred for production of food additives. For plasmid-free 5KF production IK003.1::fdhSCL2 was developed. The 5KF production rate and yield obtained with this strain were considerably higher than for the single integration strains and approached the values of IK003.1 with plasmid-based fdhSCL expression. By the additional plasmid-based invertase integration, sucrose was used as a renewable and cheaper carbon source for 5KF production. Improving the cultivation conditions led to reduction of cultivation time by 40%, sucrose cleavage increased by 36% and OD600 increased 2.5 times. To achieve valuable information on profitability already at early stage of the process development, a process model was developed with SuperPro Designer® and used to determine the most effective process optimisation. The economy of scale showed the largest impact on 5KF production. The process optimisations conducted in this works successfully reduced the production cost by 14%. The production cost could potentially be further decreased by 20% if sucrose was used as the sole carbon source.
OpenAccess: 
PDF
(additional files)
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online
Sprache
English
Externe Identnummern
HBZ: HT021684518
Interne Identnummern
RWTH-2022-11432
Datensatz-ID: 860502
Beteiligte Länder
Germany
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