Untersuchung der ATP-Hydrolyse in der ATPase SmsC mittels einer Festkörper-Kernresonanzspektroskopie-Toolbox
Coordinator
Professor Dr. Thomas Wiegand
Grant period
2021 -
Funding body
Deutsche Forschungsgemeinschaft
DFG
Identifier
G:(GEPRIS)455240421
Note: Protein-Nukleotid-Wechselwirkungen spielen eine zentrale Rolle in der Biologie und steuern eine Vielzahl von Prozesse wie ATP-Hydrolyse, DNA-Replikation, Transkription und DNA/RNA-Reparatur, die alle auf sehr spezifische molekulare Wechselwirkungen für eine hohe Funktionalität beruhen. Nichtkovalente Wechselwirkungen (NCIs, u.a. Wasserstoffbrücken, Dispersionswechselwirkungen) stehen im Mittelpunkt der molekularen Erkennungsvorgänge zwischen Proteinen und Nukleotiden und sind für die hohe Selektivität solcher Prozesse verantwortlich. Die NMR-Spektroskopie spielt eine wichtige Rolle bei der Untersuchung solcher Interaktionen, da sie häufig durch molekulare Dynamik beeinflusst werden. In diesem Fortsetzungsantrag planen wir, unsere Festkörper-NMR-Toolbox zu erweitern und anzuwenden, um Protein-Nukleotid-Wechselwirkungen am Beispiel der ATPase SmsC zu untersuchen, die zum Sms-System gehört und für die Bildung von Fe-S-Clustern verantwortlich ist. Aus methodischer Sicht wollen wir die 19F-detektierte Festkörper-NMR-Spektroskopie bei schnellen Rotationsfrequenzen um den magischen Winkel (>100 kHz) in unsere Toolbox integrieren, was uns die Bestimmung von Abstandsrestraints zwischen 19F-markierten Nukleotiden und dem Protein ermöglicht. Diese Untersuchungen werden durch protonendetektierte Experimente ergänzt, die die Positionierung des Nukleotid-Phosphat-Rückgrats in der Nukleotid-Bindungsdomäne ermöglichen. Die Geometrie des Phosphatrückgrats wird durch homonukleare 31P-31P-Abstandsmessungen zugänglich gemacht, die durch computergestützte Modellierung ergänzt werden. Diese erweiterte Toolbox („NONCOV 2.0“) wird anschließend auf ein anspruchsvolles biologisches System angewandt, nämlich die ATPase SmsC, für die wir ein detailliertes Verständnis des Mechanismus der ATP-Hydrolyse erzielen wollen. Erste eigene Vorarbeiten haben gezeigt, dass SmsC sogar mehrere ATP-Analoga hydrolysiert, die als „nicht hydrolysierbar“ gelten. Damit ist dieses Protein ein hervorragender Kandidat für die Erweiterung unserer Toolbox für zeitaufgelöste Festkörper-NMR-Studien, da solche ATP-Analoge die Hydrolysereaktion ausreichend verlangsamen. Protonen-detektierte schnelle MAS-Experimente in Kombination mit 31P MAS NMR werden es uns ermöglichen, Konformationsänderungen und dynamische Veränderungen im Protein während der Hydrolyse solcher ATP-Analoge mit Aminosäureauflösung zu verfolgen. Wir werden die ATP-Hydrolyseeigenschaften, z.B. die Kinetik, von SmsC mit denen des SmsCB-Komplexes vergleichen, um den Einfluss von SmsB auf SmsC im Sms-System besser zu verstehen. Neben den biologisch relevanten Einblicken in das Sms-System zielt unser Antrag darauf ab, eine breit einsetzbare Festkörper-NMR-Toolbox zur Untersuchung und Quantifizierung von NCIs in Protein-Nukleotid-Komplexen zu entwickeln.
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