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000953448 245__ $$aThe analysis of fluorescence fluctuations by means of the mean single-molecule rate (mSMR)$$cvorgelegt von Lorenz Tim Sparrenberg (M.Sc.)$$honline
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000953448 5203_ $$aDie Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) ist ein wichtiges Werkzeug für die Analyse biologischer Systeme auf Einzelmolekülebene. Über die Jahre wurden verschiedene Methoden entwickelt, die auf dem Prinzip der FFS beruhen. Sie lassen sich grob in zwei Kategorien einteilen. Methoden der ersten Kategorie untersuchen Fluktuationen in der Zeitdomäne und umfassen u.a. die bekannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und ihre Varianten. Methoden der zweiten Kategorie analysieren Fluktuationen in der Amplitudendomäne, wozu z.B. das photon counting histogram (PCH) gehört. In dieser Arbeit wird eine neue Methode entwickelt, die Informationen aus beiden Domänen vereint, die mean single-molecule rate (mSMR). Sie basiert auf Mandels Q-Parameter, der aus den ersten beiden Kumulanten einer Fluoreszenzspur berechnet wird. Die Kumulanten können für beliebige Aggregationszeiten einer Fluoreszenzspur ausgedrückt werden, wodurch sich der Q-Parameter als zeitabhängige Größe ergibt. Durch eine Normierung zeigen die Q-Parameter für verschiedene Aggregationszeiten eine große Ähnlichkeit mit den Autokorrelationskurven der FCS-Analyse, was eine vergleichbare Interpretation der Daten ermöglicht. Durch die Definition der mSMR über Kumulanten, können aber auftretende Detektorartefakte korrigiert werden, was eine bessere Modellanpassung für die betroffenen Zeitskalen ermöglicht. Um die mSMR als neue Methode für die FFS-Analyse zu etablieren, wird sie in dieser Arbeit systematisch untersucht. Zunächst werden simulierte Fluoreszenzspuren analysiert. Es zeigt sich, dass die mSMR die Simulationsparameter auch bei Vorliegen von Rauschen und Detektorartefakten exakt reproduzieren kann. Für die anschließende Analyse von Fluoreszenzspuren des Farbstoffs Alexa Fluor 488 kommt ein selbstgebauter konfokaler Plate Reader zum Einsatz. Dieser führt automatisch FFS-Messungen in einer 384-Well Mikrotiterplatte durch und erlaubt dadurch schnelle und wiederholbare Messungen. Bei der Analyse der Fluktuationen liefern die mSMR und die etablierte FCS vergleichbare Ergebnisse. Auf kurzen Zeitskalen erbringt die mSMR aber bei Messungen mit wenigen Photonenereignissen plausiblere Ergebnisse. Zum Schluss wird die mSMR für die Analyse von DNA-Mischungen mit definierter Fragmentlängenzusammensetzung verwendet und Kalibrierkurven erhoben. Basierend auf diesen Ergebnissen werden DNA-Sequenzierbibliotheken charakterisiert und die Massenkonzentration, die mittlere Fragmentlänge sowie die Molarität der Proben bestimmt. Dabei liefert die mSMR vergleichbare Ergebnisse wie das übliche mehrstufige Verfahren aus Fluoreszenzspektroskopie und Kapillargelelektrophorese. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die mSMR eine sinnvolle Erweiterung der bisherigen FFS-Methoden darstellt. Insbesondere für Messungen mit wenigen Photonenereignissen stellt die mSMR eine robuste und zuverlässige Methode dar. Durch die Korrektur von Detektorartefakte kann die mSMR auch Fluktuationsereignisse auf sehr kurzen Zeitskalen auflösen und so genauere Analysen von photokinetischen Effekten ermöglichen.$$lger
000953448 520__ $$aFluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) is an important tool for the analysis of biological systems at the single-molecule level. FFS methods can be roughly divided into two categories. Methods of the first category examine fluctuations in the time domain and include the well-known fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and its variations. Methods of the other category analyze fluctuations in the amplitude domain and include the photon counting histogram and related methods. In this thesis, the mean single-molecule rate (mSMR) is introduced as a new method, which uses information from both the time and amplitude domain. The mSMR is based on Mandel’s Q parameter, which can be calculated from the first two cumulants of a fluorescence trace. The cumulants can be expressed for arbitrary sampling times of a fluorescence trace, which yields the Q parameter as a sampling time-dependent quantity. By normalizing the Q parameter to its corresponding sampling time, data curves are obtained which show great similarities to the autocorrelation curves in FCS analysis and enable a comparable interpretation of the data. The model definition based on cumulants allows direct correction of common detector artefacts such as afterpulsing or dead time. For evaluation, the mSMR is subjected to a series of systematic analyses. Firstly, it was applied to simulated fluorescence traces since the simulation enables precisely adjustable parameters. It was shown that the mSMR model accurately reproduces the input parameters of the simulation both in the absence and presence of noise and detector artefacts. Secondly, the mSMR was used to analyze fluorescence traces of the dye Alexa Fluor 488 recorded with a home-built confocal plate reader. Our reader automatically conducts FFS measurements in a microtiter plate, thus enabling easy and repeatable measurements with low hands-on time. A visual and statistical comparison between the mSMR and the established FCS showed that the mSMR provides generally comparable results to the FCS method. At low excitation powers and low concentrations, however, the mSMR provides more plausible results on short time scales. This is of particular importance for the analysis of photokinetic effects. Thirdly, to show the relevance of the mSMR for biological systems, measurements were performed on DNA mixtures of defined fragment length composition. Here, too, the mSMR retrieved precise results that are in line with theoretical expectations. Based on these findings, libraries for DNA sequencing were characterized and mass concentration, mean fragment length and molarity of the libraries were determined. In just one measurement, the mSMR could provide the same results as a commonly used multistep procedure consisting of fluorescence spectroscopy and capillary gel electrophoresis. The mSMR represents a meaningful extension of previous FFS methods. The findings of this work suggest that especially for measurements with few photon events, e.g., at low excitation powers and concentrations, the mSMR is a robust and reliable method. In combination with the correction of detector artefacts, the mSMR can resolve fluctuation events on very short time scales and permits high-precision analyses of fluorescence fluctuations. This provides new insights into the analysis of photokinetic effects.$$leng
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