Investigation of protein secretion in microscale cultivation systems with novel tools

Müller, Carolin; Oldiges, Marco; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2023-04029

Investigation of protein secretion in microscale cultivation systems with novel tools

Müller, Carolin^RWTH*

2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science (M. Sc.) Carolin Müller

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

UmfangOnline-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Oldiges, Marco (Thesis advisor)^RWTH* ; Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-03-16

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-04029
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/956251/files/956251.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Bis heute ist es nicht möglich, ein geeignetes Signalpeptid für die Sec-abhängige Sekretion heterologer Proteine in Gram-positiven Bakterien vorherzusagen. Stattdessen müssen Signalpeptide für jeden Wirt und jedes Zielprotein unter Prozessbedingungen getestet werden. Darüber hinaus können auch die Ribosomen-Bindungsstelle und insbesondere der Spacer zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Startcodon des Signalpeptids die Proteinsekretion beeinflussen. Um die Identifizierung geeigneter Signalpeptid-Zielprotein-Kombinationen zu beschleunigen, wurden automatisierte Arbeitsabläufe für die gezielte Stammkonstruktion und das Hochdurchsatz- Screening für die heterologe Proteinsekretion in Corynebacterium glutamicum etabliert, die an verschiedene Zielproteine angepasst werden können. Eine Plasmidbibliothek mit verschiedenen Bacillus subtilis Signalpeptiden wurde mit dem neu entworfenen pPBEx2-basierten Plasmid pCMEx12 konstruiert, das den Austausch der Ribosomenbindungsstelle einschließlich der Spacer-Sequenz sowie der Signalpeptidsequenz durch Kassettenmutagenese ermöglicht. Bei dieser Methode werden die Inserts als hybridisierte Oligonukleotide bereitgestellt, die nicht vollständig komplementär sind, sondern Überhänge aufweisen, die mit einem entsprechenden restriktionsverdauten pCMEx-Plasmid ligiert werden können. Für die Sekretion des Zielproteins kann in pCMEx-basierten Plasmiden das Reportergen, das für ein blaues Chromoprotein unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors kodiert, durch Golden Gate Assemblierung mit dem gewünschten Gen ausgetauscht werden, wobei Restriktion und Ligation in einem Prozessschritt kombiniert werden. Da das Chromoprotein nach der Transformation zu blauen Kolonien führt, kann eine erfolgreiche Klonierung durch eine Änderung der Koloniefarbe von blau nach weiß nachgewiesen werden, zusätzlich zu einem Restriktionsenzym-Testverdau, bei dem die Anzahl und Größe der DNA-Fragmente vom Insert abhängt. Das Zielgen wird dann zusammen mit einem aminoterminalen Signalpeptid mit einem kurzen Linker und einem Carboxy-terminalen 11. β-Faltblatt des grün fluoreszierenden Proteins (GFP, GFP11-tag) unter der Kontrolle des induzierbaren tac-Promotors exprimiert. Mit Hilfe eines Opentrons OT-2 Pipettierroboters mit integriertem Temperatur- oder Magnetmodul wurden die Klonierungsschritte Golden Gate Assemblierung, Escherichia coli Hitzeschock-Transformation, Plasmidreinigung und Testverdauung automatisiert. Dadurch konnte die Prozesszeit für diese Klonierungsschritte auf etwa 58% der Zeit für den manuellen Prozess reduziert werden. Zum Testen von Workflows für die Kultivierung mit Online-Produktmessung wurde der Stamm C. glutamicum pPBEx2-PhoDCg-GFP erfolgreich erstellt, der eine streng kontrollierte Induktion der GFP-Sekretion ermöglicht. Ein automatisierter Hochdurchsatz-Screening Workflow wurde auf einer Tecan Freedom EVO® Robotikplattform entwickelt mit integrierter Zentrifuge, Mikroplattenlesegerät und einem BioLector® für die Mikrokultivierung mit Online-Messung des Rückstreusignals, das mit dem Zelltrockengewicht korreliert. Die automatisierte Handhabung der Vorkulturen und die durch Rückstreuung ausgelöste Inokulation der Hauptkulturen und Induktion gewährleisten eine hohe Vergleichbarkeit des Bakterienwachstums. Mit diesem Workflow wurden geeignete Kombinationen von Ribosomenbindungsstellen und B. subtilis Signalpeptiden für die Sekretion der Fusarium solani f. sp. pisi Cutinase-GFP11 mit C. glutamicum identifiziert. Cutinase-GFP11 im Kultivierungsüberstand wurde 4 h nach Induktion durch Aktivitätsmessung und aktivitätsunabhängig durch Assemblierung des GFP11-tags mit GFP1-10 in der zugegebenen Detektorlösung mit anschließender Chromophorbildung im Split GFP Assay nachgewiesen. Die Prozessdauer von der Kultivierung von bis zu 12 verschiedenen Stämmen bis zum Nachweis des Zielproteins im Überstand beträgt etwa 1,5 Tage, wobei manuelle Eingriffe nur zu Beginn der Kultivierung und vor den Assays erforderlich sind. Für Hochdurchsatz-Screenings werden ausreichende Mengen an Detektorlösung benötigt. Daher wurde ein Fed-Batch Kultivierungsprozess für die GFP1-10 Produktion im Labormaßstab in Bioreaktoren etabliert und es konnte Detektorlösung für bis zu 385 Screenings in 96-Well-Platten gewonnen werden. Aspekte der Stabilität des GFP1-10 Detektorproteins, der Lagerung und der Assay-Inkubationsbedingungen wurden untersucht. Nach einem Proof-of-Concept mit der Cutinase, einem Modellprotein für die heterologe Proteinsekretion, wurde ein B. subtilis Signalpeptid-Screening für die Sekretion der Polyethylenterephthalat-abbauenden Enzyme Leaf-branch compost cutinase (LCC) und PE-H durchgeführt. Dafür wurde die Kultivierung optimiert, um den Vergleich von bis zu 24 verschiedenen Stämmen in einem Durchgang zu ermöglichen. Mit Hilfe eines Prozessmodells, das Bayes’sche Inferenz und Thompson-Sampling kombiniert, wurde das beste von 24 Signalpeptiden mit einer Wahrscheinlichkeit von 80% für die PE-H und 75% für die LCC nach nur drei Batch-Kultivierungen identifiziert.

Until today, it is impossible to predict a suitable signal peptide for Sec-type secretion of heterologous proteins in Gram-positive bacteria. Instead, signal peptides have to be tested for each host and target protein under process conditions. In addition, the ribosome binding site and in particular the spacer between the Shine-Dalgarno sequence and the start codon of the signal peptide can also affect protein secretion. To accelerate the identification of suitable combinations of signal peptides and target proteins, automated workflows for targeted strain construction and high-throughput screening for heterologous protein secretion in Corynebacterium glutamicum were established, which can be easily adapted to different target proteins. A plasmid library with different Bacillus subtilis signal peptides was constructed in the newly designed pPBEx2-based plasmid pCMEx12, which allows the exchange of the ribosome binding site including the spacer sequence as well as the signal peptide sequence by cassette mutagenesis. In this method, the inserts are provided as hybridized oligonucleotides that are not fully complementary, but have overhangs that can be ligated to the restriction digested backbone. For target protein secretion with pCMEx-based plasmids, a reporter gene coding for a blue chromoprotein under the control of a constitutive promoter can be exchanged with the gene of interest by Golden Gate assembly, combining restriction and ligation in a one-pot setup. Since the chromoprotein leads to blue colonies after transformation, successful cloning can be detected by a change in colony color from blue to white, in addition to a restriction enzyme digest in which the number and size of DNA fragments depend on the insert. The gene of interest is then expressed in frame with an amino-terminal signal peptide and carboxyl-terminally linked to the 11th β-sheet of the green fluorescent protein (GFP, GFP11-tag) under the control of the inducible tac promoter. The molecular cloning steps of the Golden Gate assembly, the Escherichia coli heatshock transformation, the plasmid purification and the restriction digest were automated using the Opentrons OT-2 liquid handling robot with integrated Temperature or Magnetic Module. This reduced the process time for molecular cloning to about 58% of that for the manual process. For testing cultivation workflows with online product monitoring, the C. glutamicum pPBEx2-PhoDCg-GFP enabling tightly controlled induction of GFP secretion was successfully prepared. An automated high-throughput screening workflow was developed on a Tecan Freedom EVO® robotic platform with an integrated centrifuge, microplate reader, and BioLector® for microscale cultivation with online measurement of the backscatter signal that correlates to cell dry weight. Automated preculture handling and backscatter-triggered inoculation of main cultures and induction ensure high comparability of bacterial growth. Using this workflow, suitable combinations of ribosome binding sites and B. subtilis signal peptides were identified for Fusarium solani f. sp. pisi cutinase-GFP11 secretion by C. glutamicum. Cutinase-GFP11 in the cultivation supernatant was detected 4 h after induction via activity measurement and activity-independently by assembly of the GFP11-tag with GFP1-10 in added detector solution by holo-GFP fluorescence in split GFP assay. The process time from cultivation of up to 12 different strains to detection of the target protein in the supernatant is about 1.5 days, with manual operations only required at the start of cultivation and prior to the assays. For high-throughput screening approaches, sufficient quantities of detector solution is needed. Therefore, a fed-batch cultivation process for the GFP1-10 production in laboratory-scale bioreactors was established and detector solution for up to 385 screenings in 96-well plates could be obtained. Aspects of GFP1-10 detector protein stability, storage and assay incubation conditions have been investigated. After a proof-of-concept using the secretion model protein cutinase, a B. subtilis signal peptide screening for secretion of polyethylene terephthalate degrading enzymes leaf-branch compost cutinase (LCC) and PE-H was conducted. For this, the cultivation workflow was optimized to allow the comparison of up to 24 different strains in one run. Using a process model combining Bayesian inference and Thompson sampling, the best of 24 signal peptides was identified with a probability of 80% for the PE-H and 75% for the LCC after only three batch cultivations.

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