Assessment of a novel high-throughput process development platform for biopharmaceutical protein production

Opdensteinen, Patrick; Buyel, Johannes Felix; Schillberg, Stefan Johannes

doi:10.18154/RWTH-2023-04267

Assessment of a novel high-throughput process development platform for biopharmaceutical protein production = Einschätzung einer neuen Hochdurchsatz-Prozessentwicklungsplattform für die biopharmazeutische Proteinproduktion

Opdensteinen, Patrick^RWTH*

2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Patrick Opdensteinen, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Buyel, Johannes Felix (Thesis advisor)^RWTH* ; Schillberg, Stefan Johannes (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-04-11

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-04267
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/956637/files/956637.pdf

Einrichtungen

Projekte

GRK 2375 - GRK 2375: Tumor-Targeted Drug Delivery (331065168) (331065168)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
MRSA (frei) ; automation (frei) ; biopharmaceuticals (frei) ; high-throughput screening (frei) ; plant molecular farming (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Pflanzen können etablierte Expressionssysteme wie Escherichia coli und „Chinese hamster ovary“ (CHO) Zellen im Kontext von Infektionskrankheiten durch zusätzliche Produktionskapazitäten ergänzen. Im Vergleich zu diesen Systemen sind jedoch nur wenige Hochdurchsatz-Screening-Tools verfügbar, die die Entwicklung von Biopharmazeutika in Pflanzen erleichtern. Um diesen Zustand zu verbessern, wurden Hochdurchsatztechniken während der Klonierung, Expression, Reinigung und Quantifizierung implementiert, um den Durchsatz während des gesamten Entwicklungsprozesses zu erhöhen. Dieses Konzept wurde auf eine transiente Expression in Nicotiana spp. angewandt, da transiente Produktionsprozesse in nur 3 Wochen etabliert werden können und damit schnell auf neue Anforderungen reagieren können. Kombiniert mit statistischer Versuchsplanung ermöglichten es die etablierten Hochdurchsatz-Screening-Tools Kombinationen von Promotoren, 5' UTRs und Signalsequenzen zu identifizieren, die die Akkumulation von Zielproteinen maximieren. Diese Strategie wurde eingesetzt, um Interleukine, Polyphosphatkinasen, IgG3-Antikörper, Biofilm-abbauende Enzyme und Endolysine für eine holistische Strategie gegen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) herzustellen. Durch das systematische Screening von Vektorelementen wurde in Pflanzen eine dreifach höhere IgG3-Akkumulation erreicht als in der Literatur beschrieben. Dispersin B erreichte Akkumulationslevel äquivalent zu E. coli. Weitere Verbesserungen können in Zukunft durch die Erweiterung der untersuchten Vektorelemente, insbesondere mit synthetischen Promotoren, 3' UTRs und Terminatoren erreicht werden. Die aus Pflanzen gewonnenen Zielproteine waren funktionsfähig, mit Ausnahme einer verminderten Aktivität von Polyphosphatkinasen, was dafürspricht, dass Nicotiana spp. rekombinante Proteine zur Bekämpfung von MRSA produzieren kann. Mit Hilfe der etablierten Screening-Tools können in Zukunft weitere Proteine in Pflanzen produziert und auf ihre Aktivität gegen MRSA untersucht werden. Basierend auf einem aktuellen Ansatz in der Entwicklung von Biopharmazeutika wurden Parametern identifiziert, die die Auswahl von Proteinkandidaten und Optimierungsstrategien leiten können. So erlaubte beispielsweise der Ursprung eines Zielproteins eine Vorauswahl geeigneter Expressionskompartimente und eine Verringerung des Screening Aufwandes. Die Bewertung der intrinsischen Proteinstabilität ermöglichte es, ungeeignete Proteinkandidaten innerhalb einer Proteinklasse auszusortieren. Die Medium Osmolalität (Wasser Aufnahme) kann für die Optimierung von Medien für die Pflanzenzellkultur herangezogen werden. Die Charakterisierung von Wirtszellproteinen, die nach der Chromatographie bestehen blieben, ermöglichte die Entwicklung von Reinigungsstrategien, die ihre Entfernung erleichtern.

Plants can complement dominant expression systems such as Escherichia coli and Chinese hamster ovary (CHO) cells with additional production capacity in response to emerging infectious diseases, but compared to these hosts few high-throughput screening tools that facilitate biopharmaceutical development have been available in plants. To advance this situation, high-throughput techniques were implemented during cloning, expression, purification and quantification, thus increasing the screening throughput across the entire development process. This concept was applied to a transient expression in Nicotiana spp., which allows to establish production processes in as little as 3 weeks and thus quickly react to changing demands. In combination with statistical design of experiments, the established high-throughput screening tools allowed to rapidly clone and test libraries of expression cassette elements such as promotors, 5′ UTRs and signal sequences and identify combinations thereof that maximize target protein accumulation. This strategy was successfully employed to produce interleukins, polyphosphate kinases, IgG3 antibodies, biofilm degrading enzymes and endolysins selected for a multilayered strategy directed against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Notably, IgG3 accumulation levels achieved by systematically screening expression cassette elements were threefold higher than the literature. Using the same strategy, dispersin B accumulation levels equivalent to E. coli were reached. Further improvement can be expected in the future by expanding the set of expression cassette elements used for screening, particularly with synthetic promotors, 3′ UTRs and terminators. Plant-derived target proteins were functional, except for a reduced enzymatic activity of polyphosphate kinases, indicating that Nicotiana spp. can supply recombinant proteins to counter emerging MRSA. Using the high-throughput screening tools established herein, additional plant-made proteins can be rapidly assessed for their usefulness against MRSA in the future.In accordance with a recent approach in biopharmaceutical development, data generated with the different target proteins were used to identify parameters that can guide the selection of candidate proteins and even optimization strategies. For instance, the target protein origin had a major impact on the ideal expression compartment, thus allowing to pre-select suitable expression compartments and reduce the screening workload. Assessing intrinsic protein stability parameters allowed to sort out unsuitable candidate proteins, albeit currently limited to comparisons within the same protein class. A parameter that can guide the optimization of plant cell cultivation media is the medium osmolality, essentially controlling the uptake of water into plant cells. Characterization of host cell proteins that persist after chromatography allowed to derive purification strategies that facilitate their removal.

OpenAccess:
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