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000964034 245__ $$a"Verbesserte Pipeline für die In-silico-Entwicklung von Arzneimitteln bei schwierigen Proteinen"$$cvorgelegt von Jonas Goßen M.Sc.$$honline
000964034 246_3 $$aImproved in silico drug design pipeline targeting challenging protein targets$$yEnglish
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000964034 502__ $$aDissertation, RWTH Aachen University, 2023$$bDissertation$$cRWTH Aachen University$$d2023$$gFak01$$o2023-01-18
000964034 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
000964034 5203_ $$aIn den letzten zehn Jahren lag die Wahrscheinlichkeit, dass eine neue molekulare Leitsubstanz zu einem von der FDA zugelassenen Arzneimittel optimiert wird, bei nur 7%. Neben der Schwierigkeit, toxische Wirkungen vorherzusagen, ist dies vor allem auf Probleme mit der Wirksamkeit des Medikaments zurückzuführen, die häufig erst in den letzten Schritten der Arzneimittelzulassung auftreten. Vor allem in der Phase der klinischen Erprobung werden Nebenwirkungen zu einem ernsten Problem. Die computergestützte Entwicklung von Arzneimitteln (Computer-aided drug design, CADD) hat einen zunehmenden Einfluss auf die Bewältigung dieser Herausforderungen, indem sie durch die Analyse der chemischen Struktur a-priori-Schätzungen der Wirksamkeit, Toxizität und Nebenwirkungen von Arzneimitteln ermöglicht. Obwohl solche Vorhersagen noch einige Einschränkungen aufweisen, beschleunigt CADD die Prozesse in der Arzneimittelentwicklung bis zu einem gewissen Grad. In dieser Arbeit habe ich CADD-Techniken für vier Proteine von pharmakologischer Bedeutung entwickelt und angewendet: Das erste Protein ist der Adenosinrezeptor Typ 2a, ein Ziel für nicht-dopaminerge Interventionen bei der Parkinson-Krankheit. Eine umfangreiche virtuelle Bibliothek mit kleinen arzneimittelähnlichen Molekülen (etwa 4,5 Millionen Moleküle) wurde virtuell gescreent. Der in-silico-Prozess wurde durch die Entwicklung eines maschinellen Lernmodells (Random Forest) verbessert, um Testkandidaten mit agonistische Bindungsmustern herauszufiltern, die denen von in der Literatur gefundenen Agonisten ähneln. Eine Teilmenge von 12 potenziellen Antagonisten wurde für in-vitro-Tests am Institut für Neurowissenschaften und Medizin 5 (Forschungszentrum Jülich) ausgewählt. Ein Molekül zeigte dabei eine gute Affinität (Ki) von 310±23,4 nM zum Adenosinrezeptor Typ 2a im Rahmen eines in-vitro-Radioligandenbindungstests. Das zweite Zielprotein war die Hauptprotease von SARS-CoV-2 (Mpro), die eine Schlüsselrolle bei der viralen Replikation einnimmt. Etwa 30.000 Konformationen des Proteins in Lösung, die aus der Molekulardynamiksimulation der Gruppe von David Shaw extrahiert worden waren, wurden mit Hilfe von TRAPP und SiteMap, zwei Tools zur Bestimmung der Wirkstoffbindung, ausgewählt. Anschließend wurde eine Molekülbibliothek an diese Konformationen angedockt. Die Bibliothek umfasste kommerzialisierte Medikamente, in der Wirkstoffentwicklung befindliche Verbindungen, die interne chemische Bibliothek des Pharmaunternehmens Dompè, Verbindungen aus der BROAD Repurposing-Bibliothek des Fraunhofer-Instituts und bekannte SARS-CoV-1 Mpro-Inhibitoren. Sie wurden verwendet, um zu verstehen, wie sich die ausgewählten potenziell hochwirksamen Proteinkonformationen verhalten, wenn sie mit Molekülen aus einem vielfältigen chemischen Raum untersucht werden. Schließlich wurde das erworbene Wissen genutzt, um eine Wirkstoffhypothese für das Screening mit der EU-OPENSCREEN Bibliothek bioaktiver Substanzen zu erstellen. Unser Pharmakophormodell für SARS-CoV-2 sagte zwei Liganden mit nanomolarer Affinität voraus: Benserazid und Myricetin. Die enzymatische Aktivität wurde durch einen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) von unseren Kollegen im Fraunhofer Institute ü für Translationale Medizin und Pharmakologie (ITMP) in Hamburg vermessen. Die Messungen bestätigen, dass sie nanomolare Affinität für die SARS-CoV-2-Hauptprotease und eine gewisse antivirale Wirkung in menschlichen, mit SARS-CoV-2 infizierten, Calu-3-Zellen aufweisen. Anschließend wurden CADD-Techniken angewandt, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zu zwei krebsbezogenen Proteinzielen zu analysieren. Es wurde ein neuer Inhibitor der BET-Familie (Bromodomäne und extraterminale Domäne) gefunden, der in myeloischen Zelllinien und Primärzellen von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) aktiv ist. Die in dieser Arbeit angewandten Berechnungen rationalisierten das unterschiedliche Verhalten der (S/R)-Enantiomere des Inhibitors als aktiv/inaktiv. Schließlich wurden die in-vitro-Bindungsorientierungen von Furosemid für an MitoNEET, ein Ziel für pharmazeutische Krebsinterventionen, berechnet. Für das Protein waren sowohl experimentelle Strukturinformationen als auch Messungen der Bindungsaffinität verfügbar. Die Berechnungen basierten auf Localized Volume-based Metadynamics (LV-MetaD), einem erweiterten Sampling-Schema, und volumenbasierter Metadynamik, die darauf hindeuten, dass der Ligand in mehreren isoenergetischen Posen bindet, einschließlich derjenigen, die sich aus der Röntgenstruktur ergibt. Diese Studie liefert eine Schätzung der Affinität, die vollständig mit der experimentell ermittelten Affinität übereinstimmt, was die Vorhersagekraft dieser Methoden zeigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit CADD-Techniken angewandt und erweitert wurden, um nicht nur ihre Möglichkeiten bei der Hit-to-Lead-Entwicklung und bei Aktivitäts-/Toxizitätsvorhersagen aufzuzeigen, sondern auch, um Struktur-Wirkungs-Beziehungen im Kontext der Arzneimittelentwicklungspipeline zu erklären.$$lger
000964034 520__ $$aFor the last decade, the probability of optimizing a new lead molecular entity to an FDA-approved drug was as low as 7\%. Besides the challenge of predicting toxic effects, this is majorly due to drug efficacy problems, which frequently arise in the last steps of the drug approval. Specifically, side effects become a severe concern in the clinical trials phase. Computer-aided drug design (CADD) techniques have an increasing impact in dealing with these challenges by a-priori estimations of drug efficacy, toxicity, and side effects by analyzing the chemical structure. Although such predictions still have several limitations, CADD speeds up processes in the drug development process to a certain degree. In this thesis, I developed and applied CADD techniques to four proteins of pharmacological importance: The first protein is the adenosine receptor type 2a, a target for non-dopaminergic intervention in Parkinson's disease. A sizeable virtual library consisting of small drug-like molecules ($\approx4.5$ million molecules) was virtually screened. The in-silico process was enhanced by developing a machine-learning (random forest) model to filter out test candidates showing agonistic binding patterns learned by antagonists and agonists found in the literature. A subset of 12 potential antagonists was selected for in-vitro testing at the Institute of Neuroscience and Medicine 5 (Forschungszentrum Jülich). One molecule showed a fair affinity (K$_\mathrm{i}$) of 310$\pm$23.4~nM to the adenosine receptor type 2a within an in vitro radioligand binding assay. The second protein target was the main protease of SARS-CoV-2 (Mpro), which inhabits a key role in viral replication. Around 30,000 conformations of the protein in solution extracted from {$\sim$}\,1 $\mu$s Molecular Dynamics simulation of David Shaw group were selected using TRAPP and SiteMap, two druggability tools. Then, a molecular library was docked to these conformations. The library included commercialized drugs and compounds under development, the internal chemical library from Domp\`e pharma company, compounds from the Fraunhofer Institute BROAD Repurposing Library, and known inhibitors SARS-CoV-1 Mpro. They were used to understand how the selected potentially highly-druggable protein conformations perform when probed with molecules coming from a diverse chemical space. Finally, this acquired knowledge has been exploited to generate an active-pharmacophore hypothesis for screening against the EU-OPENSCREEN Bioactive Compound Library. Two ligands were predicted to bind with a nanomolar affinity by our pharmacophore model for SARS-CoV-2: Benserazide and Myricetin. Enzymatic activity was measured by an F{\"o}rster resonance energy transfer (FRET) by our colleagues at the Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology (ITMP) in Hamburg. The measurements confirm that they are nanomolar affinity binders of SARS-CoV-2 main protease with some antiviral property in human Calu-3 cells infected with SARS-CoV-2. Next, CADD techniques were also applied to analyse structure-activity relationships to two cancer-related protein targets. A new bromodomain and extra-terminal domain (BET) family inhibitor with activity in myeloid cell lines and primary cells from patients with acute myeloid leukemia (AML) was found. The calculations applied in this thesis rationalized the different behaviours of (S/R)-enantiomers of the inhibitor as active/inactive. Lastly, the in-vitro binding orientations of furosemide binding to mitoNEET, a target for pharmaceutical cancer intervention, were calculated for which both experimental structural information and binding affinity measurements are available. Calculations were based on Localized Volume-based Metadynamics (LV-MetaD), an enhanced sampling scheme, and volume-based Metadynamics, suggest that the ligand binds to several isoenergetic poses, including the one emerging from the X-ray structure. This study provides an estimate of the affinity fully compatible with the experimentally determined one showing the predictive power of these methods. Summarizing, in this thesis, CADD techniques were applied to show not only the prospective capabilities in the hit-to-lead development, and activity/toxicity predictions, but also to explain structure-activity relationships in the context of the drug-development pipeline.$$leng
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