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000968643 245__ $$aPseudomonas taiwanensis VLB120 synthetic biology: parts, modules, and chassis$$cDário Silva Neves$$honline, print
000968643 250__ $$a1. Auflage
000968643 260__ $$aAachen$$bApprimus Verlag$$c2023
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000968643 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
000968643 5203_ $$aDer Klimawandel ist ein dringendes globales Problem, das durch den Verbrauch von fossilen Brennstoffen verursacht wird, die Treibhausgase in die Atmosphäre freisetzen. Eine Möglichkeit, die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen zu reduzieren und die Auswirkungen des Klimawandels abzumildern, besteht darin, Zellfabriken zu verwenden. Zellfabriken sind biologische Systeme, die dafür entwickelt wurden, eine breite Palette von Produktenherzustellen. Diese Produkte können mithilfe erneuerbarer Ressourcen wie Pflanzenmaterial oder Algen hergestellt werden, anstatt von fossilen Brennstoffen. Zusätzlich kann der Produktionsprozess dieser Produkte in Zellfabriken durch den Einsatz fortgeschrittener Technologien wie metabolischem Engineering und synthetischer Biologie effizienter und nachhaltiger gemacht werden. Synthetische Biologie zielt darauf ab, biologisch basierte Systeme mit neuen Funktionen durch Anwendung einer rationalen und systematischen Methode oder Erforschung des großen Kombinationspotentials von DNA zu entwickeln. Aufgrund der intrinsischen Komplexität von DNA-Shuffling und der aktuellen Einschränkungen bei der Vorhersage präziser Ergebnisse von synthetischen Biologie-Teilen ist es wichtig, synthetische Biologie-Tools ordnungsgemäß zu standardisieren und zu charakterisieren, um die Entwicklung von Zellfabriken zu unterstützen. Diese Arbeit hatte zum Ziel, das genetische Werkzeugkasten von Pseudomonas taiwanensisVLB120 zu erweitern und diese zur Generierung eines Chassis-Stamms zu verwenden, um das Produktportfolio dieser aufstrebenden industriell relevanten Zellfabrik zu erweitern. Sigma-70-abhängige Promoter-Bibliotheken wurden erstellt und in den einzelnen Genomlocus attTn7 vonP. taiwanensis VLB120 und E. coli TOP10 integriert. Jeder Promoter wurde mithilfe einer in dieser Arbeit entwickelten standardisierten Promoterstärkeeinheit charakterisiert, die die gerätespezifische Fluoreszenzausgabe mit Fluorescein kalibriert und Unterschiede im Zellwachstum berücksichtigt. Diese Charakterisierungsstandards ermöglichen es, einen Einblick darüber zu gewinnen, wie sich ein bestimmter Promoter in jedem Organismus verhält und Sets von Promotern zu erstellen, die für metabolic engineering Zwecke relevant sind. Diese Arbeit konzentrierte sich auch auf die Bewertung einer optimierten Gene expression Architektur, um eine hohe Gene expression ohne Abhängigkeit von starken Promotoren zu erreichen. Dieses Modul erreichte eine hohe Gene expression in mehreren Expressionvektoren von zweifluoreszierenden Reportergenen durch die Aufnahme von mRNA stabilisierenden und Translation verbessernden genetischen Teilen. Dieses Modul wurde auch angewendet, um die Produktivität eines kurzen Acetoin-pathway zu erhöhen und die Relevanz der mRNA Stabilität wurde durch qPCR-basierte mRNA Abbauraten bewiesen. Diese Werkzeuge waren ein Bestandteil in der Entwicklung einer P. taiwanensis VLB120 Propionyl-CoA Chassis-Stamm, um das Portfolio dieser Pseudomonade auf ungerade Kettenprodukte zu erweitern. Die erfolgreiche Aufnahme von Propionyl-CoA in den Stoffwechsel von P. taiwanensis VLB120 wurde durch die Produktion von Propionat bestätigt, nachdem die Löschung des Methylcitrat-Synthase als wichtiger Faktor identifiziert wurde. Der Propionat produzierende P. taiwanensis VLB120 wurde in Bioreaktor Fermentationsprozessen unter drei verschiedenen Fed-Batch-Strategien bewertet, um zu untersuchen, wie Fütterungsregime und Feast-Famine-Schaltungen die Produktion von propionyl-CoA abhängigen Produkten beeinflussen. Zusammenfassend trägt diese Arbeit zur Entwicklung von P. taiwanensis VLB120 als aufstrebende industriell relevante Werkstatt bei, indem sie das verfügbare genetische Werkzeugkasten erweitert und den ersten Schritt zur Produktion ungerader Kettenprodukte in diesem Organismus setzt. Es trägt auch zur Standardisierung der genetischen Werkzeugcharakterisierung und der Querspezies-Studien bei, mit dem Ziel, die Identifizierung des am besten geeigneten Mikroorganismus für spezifische biotechnologische Anwendungen zu unterstützen und die Unabhängigkeit von fossilen Brennstoffen zu beschleunigen.$$lger
000968643 520__ $$aClimate change is a pressing global issue that is caused by the consumption of fossil fuels, which releases greenhouse gases into the atmosphere. One of the ways to reduce dependency on fossil fuels and mitigate the effects of climate change is by using cell factories. Cell factories are biological systems that are engineered to produce a wide range of products, such as biofuels, bioplastics, and pharmaceuticals. These products can be produced using renewable resources such as plant matter or algae, rather than fossil fuels. Additionally, the production process of these products in cell factories can be made more efficient and sustainable by using advanced technologies such as metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic biology aims to engineer biologically based systems with novel functions by either applying a rational and systematic approach or exploring the vast combinatorial potential of DNA to create new-to nature molecular biology tools. Due to the intrinsic complexity of DNA shuffling and the current limitations in predicting accurate outcomes of synthetic biology parts, it is crucial to properly standardize and characterize synthetic biology tools to aid cell factory developments. This thesis aimed to expand the genetic toolbox of Pseudomonas taiwanensis VLB120 and implement them for the generation of a chassis strain to enlarge the product portfolio of this emerging industrial-relevant cell factory. Sigma-70 dependent promoter libraries were generated and integrated into the single genomic locus attTn7 of P. taiwanensis VLB120 and E.coli TOP10. Each promoter was characterized using a standardized promoter strength unit developed within this work that calibrates device-specific fluorescence output with fluorescein and accounts for cell growth-specific differences. Such characterization standards allow us to give an insight into how a specific promoter behaves in each organism and create sets of promoters relevant to metabolic engineering purposes. This thesis also focused on the assessment of an optimized gene expression architecture to achieve high gene expression without relying on strong promoters. This module achieved high gene expression across several expression vectors of two fluorescent reporter genes by incorporating mRNA stabilizing and translation-enhancing genetic parts. This module was also applied to increase the productivities of a short acetoin pathway and the relevance of mRNA stability was proven through qPCR-based mRNA decay rates. These tools were a component in the development of a P. taiwanensis VLB120 propionyl-CoAchassis strain to expand the portfolio of this pseudomonad to odd-chain products. The successful incorporation of propionyl-CoA in the metabolism of P. taiwanensis VLB120 was confirmed by the production of propionate after identifying the deletion of the methylcitrate synthase as a crucial factor. The propionate-producing P. taiwanensis VLB120 was evaluated in bioreactor fermentations under three different fed-batch strategies to assess how feeding regimes and feast-famine switches affect the production of propionyl-CoA-dependent products. In summary, this thesis contributes to the development of P. taiwanensis VLB120 as an emerging industrial-relevant workhouse by expanding the available genetic toolbox and setting the first stone to produce odd-chain products in this organism. It also contributes to the standardization of genetic tools characterization and cross-species studies to aid the identification of the most suitable microbe for specific biotechnological applications and fasten the human independence of fossil fuels.$$leng
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