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000973053 1001_ $$0P:(DE-588)1309981906$$aOlschok, Kathrin Claudia$$b0$$urwth
000973053 245__ $$aAn iPSC-derived myeloproliferative neoplasm model to study the role of CALR frameshift mutation zygosity and efficacy of telomerase inhibition$$cvorgelegt von Kathrin Claudia Olschok Master of Science RWTH Aachen University (M.Sc. RWTH)$$honline
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000973053 3367_ $$0PUB:(DE-HGF)11$$2PUB:(DE-HGF)$$aDissertation / PhD Thesis$$bphd$$mphd
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000973053 500__ $$aVeröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University
000973053 502__ $$aDissertation, RWTH Aachen University, 2023$$bDissertation$$cRWTH Aachen University$$d2023$$gFak01$$o2023-03-20
000973053 5203_ $$aBCR-ABL-negative myeloproliferative Neoplasien (MPN) sind eine Gruppe klonaler hämatopoetischer Erkrankungen, die durch eine übermäßige Proliferation myeloischer Zellen gekennzeichnet sind. Diese werden überwiegend durch Mutationen in den Genen von Januskinase 2 (JAK2) oder Calreticulin (CALR) verursacht. Frameshift-Mutationen in CALR werden bei Patienten mit essenzieller Thrombozythämie (ET) und Myelofibrose (MF) nachgewiesen. Beides sind Neoplasien, die mit einer megakaryozytären Hyperplasie im Knochenmark einhergehen. Bisher fehlen humane klonale Modellsysteme zur Untersuchung der Auswirkungen der CALR-Mutationen auf die megakaryozytäre Entwicklung in Abhängigkeit von der Zygosität der Mutation. Um dieses Problem anzugehen, konzentriert sich diese Doktorarbeit auf die Etablierung eines auf induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) basierenden Modellsystems zur Rekapitulation von CALR-positiven MPN. Mithilfe dieses Modells sollen neue Erkenntnisse über die durch mutiertes CALR verursachten Krankheitsmechanismen gewonnen werden. Zudem soll das iPS-Zellmodell dazu dienen, die Wirksamkeit der Telomerase Inhibition im Hintergrund von MPN zu evaluieren. Um mit einer umfassenden Menge an iPS-Zellklonen zu arbeiten, wurden Zellen mit homozygoten CALRdel52- und CALRins5-Mutationen mittels CRISPR/Cas9 repariert, um isogene Wildtyp iPS-Zellen (WTcr) zu generieren. Darüber hinaus wurde die Gruppe der iPS-Zellklone durch Zellen von gesunden Spendern erweitert. Mit diesen Klonen wurde ein iPS-Differenzierungsprotokoll etabliert, das die effiziente Differenzierung in myeloische Zellen und Megakaryozyten mit typischen megakaryozytären Eigenschaften ermöglicht. Das entwickelte Modellsystem simuliert einen typischen MPN-Phänotyp, da Zellen mit CALR-Mutationen eine höhere Anzahl an Megakaryozyten erzeugen als nicht mutierte WTcr-Klone. Zudem ist die Generierung von Megakaryozyten in mutierten CALR-Zellen unabhängig von Thrombopoietin. Darüber hinaus führen die CALR-Mutationen zu einer beschleunigten megakaryozytären Entwicklung, da mutierte Megakaryozyten eine frühere Expression von reifungsbezogenen Oberflächenmarkern aufweisen als nicht mutierte Megakaryozyten. Zudem wurde das gesamte Transkriptom von CALR-mutierten und nicht-mutierten Megakaryozyten analysiert. Signalwege wie Hypoxie und Interferon-Signalisierung sind in Megakaryozyten mit homozygoter CALR-Mutation hochreguliert. Demgegenüber sind Gene, die mit dem Aufbau von extrazellulärer Matrix assoziiert sind, herunterreguliert. Schließlich wurde das etablierte Differenzierungsprotokoll verwendet, um die Wirkung des Telomerase-Inhibitors Imetelstat auf JAK2-mutierte Zellen zu untersuchen. Imetelstat bewirkt eine Verkürzung der Telomerlänge in mutierten, aber nicht in gesunden hämatopoetischen Zellen und verringerte die Lebensfähigkeit von malignen Megakaryozyten, was eine krankheitsmodifizierende Wirkung von Imetelstat bestätigt.Zusammenfassend hat diese Arbeit neue Erkenntnisse über CALR-mutierte Megakaryozyten aufgezeigt, die zu einem besseren Krankheitsverständnis beitragen. Dadurch werden potenzielle neue therapeutische Optionen für CALR-positive MPN eröffnet, die mit Hilfe des etablierten Modells getestet werden können.$$lger
000973053 520__ $$aBCR-ABL-negative myeloproliferative neoplasms (MPN) are a group of clonal hematopoietic disorders characterized by excessive proliferation of myeloid cells predominantly driven by mutations in the genes of Janus kinase 2 (JAK2) or calreticulin (CALR). Among the group of MPN, frameshift mutations in CALR are found in essential thrombocythemia (ET) and myelofibrosis (MF) patients. Both neoplasms are associated with megakaryocytic hyperplasia in the bone marrow. However, human clonal model systems to study the impact of mutant CALR on megakaryocytic development depending on the zygosity of the mutation are currently missing. To address this issue, this project focused on establishing an induced pluripotent stem cell (iPSC)-based model system recapitulating CALR-positive MPN to get new insights into mutant CALR-driven disease mechanisms in megakaryocytic development. Furthermore, this iPSC-based model should serve as a platform for drug screening to identify novel therapeutic options for MPN.To obtain a comprehensive set of iPSC clones, cells with homozygous CALRdel52 and CALRins5 mutations were repaired by CRISPR/Cas9 resulting in isogenic wild type (WTcr) iPSCs. Moreover, the set of iPSC clones was extended by healthy donor iPSCs. With these clones we established an iPSC differentiation protocol allowing myeloid cell differentiation with efficient generation of megakaryocytes (MKs) that were identified by morphology and the expression of typical cell surface marker. Moreover, we analyzed the whole transcriptomic profile of purified CALR-mutated and unmutated MKs. Finally, this iPSC-model was used to evaluate the efficacy of telomerase inhibition on myeloid cells with an MPN background.Our iPSC-based model system recapitulated typical MPN-related phenotype as cells with CALR mutations generated higher numbers of MKs than related WTcr clones in a thrombopoietin (TPO)-independent fashion. Moreover, the iPSC-derived MKs exhibited typical megakaryocytic characteristics. Mechanistically, we found that the CALR mutations caused an accelerated megakaryocytic maturation as mutated MKs exhibited an earlier expression of maturation-related surface marker than unmutated MKs. Additionally, our transcriptomic analysis revealed that signaling pathways such as hypoxia and interferon signaling were upregulated while genes associated to the extracellular matrix were down-regulated in homozygously CALR-mutated MKs in contrast to WTcr MKs.The scope of the second part of the project was to use the established iPSC differentiation protocol to study the efficacy of the telomerase inhibitor imetelstat on JAK2V617F-mutated cells. Imetelstat treatment was associated with a reduction of telomere length in mutated, but not in healthy, hematopoietic cells and decreased cell viability of malignant MKs confirming a disease modifying activity of imetelstat.Collectively, we developed an iPSC-based model system that recapitulated typical characteristics of MPN. The present work provides new insights of CALR-mutated MKs that exhibited an accelerated maturation over unmutated MKs and highlighted differences in their transcriptomic profiles. This contributes to a better disease understanding and opens potential new therapeutic options for CALR-positive MPN which could be evaluated using the present iPSC model system.$$leng
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