„pH dependent migration and transcription in glioblastoma cancer stem cells“

Cortes Franco, Klaus-Daniel; Gründer, Stefan; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion

doi:HT030627532

„pH dependent migration and transcription in glioblastoma cancer stem cells“ = pH abhängige Migration und Transkription in Glioblastom Krebs-Stammzellen

Cortes Franco, Klaus-Daniel^RWTH*

2023 & 2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Klaus-Daniel Cortes Franco, Master of Science

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2024

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Gründer, Stefan (Thesis advisor)^RWTH* ; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-12-06

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-11880
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/975171/files/975171.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
ASIC (frei) ; GBM (frei) ; Glioblastoma (frei) ; PI3K (frei) ; cancer (frei) ; migration (frei) ; pH (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Glioblastoma multiforme (GBM) ist der am häufigsten vorkommende Gehirntumor, der sich durch eine sehr hohe Rezidivrate nach Behandlung auszeichnet. Dies liegt an der Invasion von Krebszellen in benachbartes gesundes Gewebe, was letztlich eine geringe Überlebensrate der Patienten zur Folge hat. Dreidimensionale GBM Stammzellen (GBM stem cells; GSCs) immortalisiert von menschlichem Tumorgewebe sind ein vielversprechendes Modell um GBM zu erforschen, da sie in Sphären wachsen und die Tumorzellen verschiedenen Tumormilieubedingungen in der Sphäre ausgesetzt sind, wodurch sie heterogen im Verhalten und wahrscheinlich auch in der Proteinexpression sind. Bisher waren noch keine Methoden etabliert, um lokalisierte Proteinexpression von GSCs innerhalb der Tumorsphäre zu untersuchen. Wir entwickelten ein Protokoll um 7-Tage alte GSCs als Tumorsphären zu fixieren und in Scheiben zu schneiden. Diese Scheiben könnten danach mit Antikörpern gefärbt und für Lokalisierungsexperimente verwendet werden. Es ist noch nicht vollkommen aufgeklärt wie Tumormilieufaktoren wie z.B. pH das Verhalten von GSCs moduliert. Um Unterschiede im Transkriptom von GSCs, die für 14 Tage in physiologischem Medium (pH 7.4) und saurem Medium (pH 6.6) inkubiert wurden, zu charakterisieren und quantifizieren, haben wir eine Ribonukleinsäure Sequenzierung und Genset Anreicherungsanalyse durchgeführt. Phosphoinosid-3-Kinase war in saurem Medium überexprimiert und war daher ein Kandidat für die Modulierung pH-abhängiger Migration in GBM. Ebenfalls sahen wir Anreicherung von biologischen Prozessen, welche die Funktion der oxidativen Phosphorylierung, der Modulierung von reaktiven Sauerstoffspezies und der exogenen Aufnahme von Fettsäuren ausüben. Die Anreicherung dieser Signalwege zeichnen ein genaueres Bild, wie Krebszellen ihr Überleben in saurem pH sicherstellen, und mit dem zusätzlichen Säurestress und ROS-Stress umgehen. Weiterhin könnten diese Signalwege Schwachstellen von GBM sein, und durch Inhibierung therapeutischen Nutzen finden.pH, als Faktor für das Tumormilieu, ist auch wichtig für die Modulierung des Migrationsverhaltens der Tumorzellen, welches wir in GSCs charakterisieren wollten. In immortalisierten einschichtig wachsenden Glioma- und GBM-Zellen wurde zuvor berichtet, dass natrium-selektive protonen-aktivierte Ionenkanäle (acid-sensing ion channels; ASICs), insbesondere ASIC1a und ASIC2, pH-abhängige Migration von GBM modulieren, indem sie als pH-Sensor agieren. Mithilfe eines Sphären-Migrationsassays sahen wir, dass GSCs in saurem Medium stärker ausmigrieren. Mit pharmakologischen Inhibitoren und Aktivatoren, als auch CRISPR-Cas9 und lentiviral modifizierten Zelllinien, konnten wir widerspruchsfrei zeigen, dass ASICs nicht die pH-abhängige Migration in unseren GSCs beeinflusst. Inhibition von Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K), allerdings, bewirkte eine verringerte Migration der GSCs in pH 6.6. Migration in pH 7.4 wurde durch PI3K Inhibition nicht beeinflusst.

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most commonly occurring brain tumour, which also has a very high recurrence rate after treatment combination, due to invasion of cancer cells into neighbouring healthy tissue, resulting in a very poor patient survival rate. Three-dimensional GBM stem cells (GSCs) isolated from human tumor tissue, are a promising cell model to study GBM, as they grow in spheres and the cells are subjected to different tumor microenvironments, thus being heterogenous in behaviour and likely also in protein expression. However, methods are lacking in researching localized protein expression differences in GBM tumourspheres. Here, we developed a protocol to immobilize and slice 7-day old GSC tumourspheres for subsequent antibody staining and localization experiments. It is not yet entirely understood, how environmental factors such as pH play a role in changing the tumor behaviour of GSCs. To determine and quantify differences in the transcriptome of GSCs incubated in physiological pH (pH 7.4) and acidic pH (pH 6.6) for 14 days, we conducted ribonucleic acid (RNA) sequencing and gene set enrichment analysis (GSEA). Expression of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) was increased at pH 6.6, making it a candidate for potentially modulating pH dependent migration. We also observed enrichment of the oxidative phosphorylation pathway, reactive oxygen species (ROS) related pathways and lipid scavenging pathways, illustrating how cancer cells ensure cell survival under acidic stress conditions and deal with increased ROS. These pathways might provide vulnerabilities that could be exploited for therapeutic gain. pH as a factor for tumor microenvironment is also essential in modulating migration, the effect of which we wanted to characterize in GSCs. In immortalized monolayer glioma and GBM cells, it has been reported that sodium-selective, proton-sensitive acid-sensing ion channels (ASICs), in particular ASIC1a and ASIC2a, mediate pH dependent GBM migration, by acting as a pH sensor. Using a sphere migration assay, we observed that acidic pH 6.6 increased migration. With inhibitors and activators of ASIC channels, CRISPR-Cas9 and lentivirally modified cell lines, we consistently showed that ASICs do not modulate pH dependent migration in GSCs. However, inhibiting PI3K decreased migration at pH 6.6. Migration at pH 7.4 was not abrogated by inhibiting PI3K.

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