Mechanisms and functional consequences of impaired keratin network formation in genetic skin disorders

Lehmann, Sonja Maria; Spehr, Marc; Leube, Rudolf; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion

doi:10.18154/RWTH-2023-12172

Mechanisms and functional consequences of impaired keratin network formation in genetic skin disorders

Lehmann, Sonja Maria^RWTH*

2022 & 2023

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sonja Maria Lehmann, M.Sc.

Ausgabe[überarbeitete Auflage]

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2023. - Überarbeitete Auflage mit Korrektur von Abbildungen

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Spehr, Marc (Thesis advisor)^RWTH* ; Leube, Rudolf (Thesis advisor)^RWTH* ; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-11-15

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2023-12172
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/975823/files/975823.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
epidermolysis bullosa simplex (frei) ; keratin intermediate filament (frei) ; pachyonychia congenita (frei) ; skin disease (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Haut stellt eine der wichtigsten Barrieren des Körpers dar. Ihre äußerste Schicht, die Epidermis, besteht hauptsächlich aus differenzierenden Keratinozyten. Die Integrität der Epidermis wird zu einem großen Teil durch das Keratin-Intermediärfilament-Zytoskelett gewährleistet. Die Bedeutung dieses Netzwerks wird durch eine Reihe von Keratinmutationen untermauert, die Krankheiten wie Epidermolysis bullosa simplex (EBS) oder Pachyonychia congenita (PC) verursachen, welche durch Keratin 5/14- bzw. Keratin 6/16/17-Mutationen ausgelöst werden. EBS ist charakterisiert durch traumabedingte Blasenbildung, die auf die Zytolyse von Keratinozyten in der basalen Schicht der Epidermis zurückzuführen ist und die auf einer Strukturveränderung des Keratinnetzwerks beruht. Statt des Zytoplasma-durchspannenden filamentösen Netzwerks entstehen periphere Keratin-Granula. PC-Patienten hingegen zeigen eine Verdickung der Epidermis mit extremer Hyperkeratose an bestimmten Hautarealen, z. B. an den Fußsohlen. Ziel dieser Arbeit war es, Einblick in die verschiedenen Pathogenesen zu gewinnen, um zum einen durch Etablierung und Anwendung neu entwickelter Bildanalysewerkzeuge mutierte EBS-Keratin-Granula quantitativ zu beschreiben, und um zum anderen zu klären, ob die Autophagie von Mitochondrien, welche einen wesentlichen Schritt innerhalb der epidermalen Differenzierung darstellt, bei PC gestört ist. Mit Hilfe von Lebendzellmikroskopie von Epithelzellen, die Fluorophor-markiertes, mutiertes Keratin stabil überexprimieren, wurde eine automatisierte Tracking-Routine entwickelt. Sie ermöglichte eine detaillierte quantitative Analyse verschiedener dynamischer Parameter der mutierten Keratin-Granula. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die Granula zunächst im äußersten Lamellum der Epithelzellen gebildet werden. Anschließend wachsen sie bis zum Erreichen eines Plateaus und werden konstitutiv mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 µm/min nach innen transportiert. Die meisten Keratin-Granula fusionieren mehrfach miteinander, bevor sie sich an der Grenze zwischen dem Lamellum und dem inneren Zytoplasma rasch auflösen. Ihr Transport ähnelt stark dem Aktin-Transport, und es konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Hemmung des Aktin-Motorproteins non-muscle Myosin II ihre gerichtete Motilität deutlich verringert. Fluoreszenz-Bleich-Experimente zeigten weiterhin, dass die Granula lösliche Keratine schnell mit dem Zytoplasma und innerhalb der Granula selbst austauschen. Die Bildung von EBS-assoziierten Keratin-Granula beruht demzufolge auf dem Prinzip der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung. Als nächstes wurde die Kinase DYRK untersucht, basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Flüssig-Phasen-Kondensate aufzulösen. Obwohl eine deutliche Kolokalisierung verschiedener überexprimierter DYRK-Isoformen und mutierter Keratin-Granula in Patienten-Keratinozyten gezeigt werden konnte, führte die pharmakologische Hemmung dieser Kinasen nicht zu einer Änderung des Prozentsatzes der Granula-positiven Zellen in verschiedenen Wildtyp-Keratinozyten-Zellklonen, die Fluorophor-markierte mutierte Keratine stabil überexprimieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Auswirkungen der mutierten Keratine auf die mitochondriale Integrität untersucht. Im Hinblick auf Makroautophagie von Mitochondrien wurde das mitochondriale Alter mit Hilfe eines Fluoreszenzreporters bestimmt. Es zeigte sich, dass PC-Zellen erhöhte Mengen an überalterten Mitochondrien enthalten, was bei EBS nicht der Fall war. Außerdem zeigte sich, dass die Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum in PC reduziert sind. Die Expression von frühen Mitophagie-Markern war nicht verändert, jedoch war der Abbau von Mitochondrien in PC-Keratinozyten stark beeinträchtigt. Obwohl die Keratinozyten in der Lage sind, Autolysosomen zu bilden, wurde gezeigt, dass sich diese Strukturen in PC stark anreichern. Die Analyse der Funktion von Lysosomen ergab eine verringerte enzymatische Kapazität, und der Phänotyp der Mitochondrien-Überalterung konnte durch pH-Veränderungen in Wildtyp-Zellen nachgeahmt werden. Daraus lässt sich schließen, dass der Prozess des autolysosomalen Recyclings, der im Anschluss an die Makroautophagie unerlässlich ist, in PC gestört ist, was zu einer beeinträchtigten Mitophagie führt. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit neue Bildanalysewerkzeuge entwickelt, die eine detaillierte Quantifizierung der Dynamik mutierter Keratine ermöglichen, und es wurde entdeckt, dass mutierte Keratine die Mitophagie und das autolysosomale Recycling in PC-Keratinozyten modulieren.

One of the most important barriers of the body is the skin. Its outermost stratified layer, the epidermis, is mainly composed of differentiating keratinocytes. The integrity of the epidermis is to a large extent provided by structural elements such as the keratin intermediate filament cytoskeleton. The importance of keratin networks is emphasised by mutation-induced keratinopathies such as Epidermolysis bullosa simplex (EBS) or Pachyonychia congenita (PC), caused by mutations in keratins 5/14 and keratins 6/16/17, respectively. EBS is characterised by trauma-induced blister formation due to rupture of keratinocytes in the basal epidermal layer, which is caused by the disruption of the keratin filament network into granular structures. PC patients, on the other hand, display epidermal thickening with extreme hyperkeratosis in certain skin areas, such as the foot soles. This work aimed to gain further insight into the different pathogeneses, in particular to apply novel image analysis tools to quantitatively describe mutant EBS keratin granules, and to investigate whether autophagy of mitochondria, representing an essential step of epidermal differentiation, is disturbed in PC. Using live-cell microscopy of epithelial cells stably overexpressing fluorophore-tagged EBS-mutant keratins, an automated tracking routine was established. It allowed a detailed quantitative analysis of different parameters of mutant keratin granule dynamics. In particular, it was shown that the mutant granules are initially formed in the outermost lamellum of epithelial cells. Subsequently, they grow up to a plateau size, and are constitutively transported inwards with a velocity of approximately 0.5 µm/min. Most keratin granules display multiple fusion events with other granules during their lifetime before they rapidly disassemble at the boundary of the lamellum and the inner cytoplasm. Their transport highly resembles actin-dependent transport, and pharmacological inhibition of the actin motor protein non-muscle myosin II significantly reduced their dynamics. Fluorescence recovery after photobleaching experiments furthermore revealed that the granules rapidly exchange soluble keratins with the surrounding cytoplasm and within the granule itself. Thus, the formation of EBS-related keratin granules is based on liquid-liquid phase separation (LLPS). The kinase DYRK was investigated next, based on its ability to dissolve different LLPS condensates. Although a clear colocalisation of different overexpressed DYRK isoforms and mutant keratin granules was shown in patient-derived EBS keratinocytes, pharmacological inhibition of the kinases did not alter the percentage of granule-containing cells in keratinocyte cell clones stably overexpressing fluorophore-tagged mutant keratins. In the second part of this work, functional consequences of mutant keratins on mitochondrial integrity were examined. First, the mitochondrial age was determined by a fluorescent reporter in both EBS and PC keratinocytes. This revealed that PC cells contain increased amounts of overaged mitochondria, which was not the case for EBS. Furthermore, contact sites between mitochondria and the endoplasmic reticulum are reduced in PC. The expression of early mitophagy markers is not changed, but clearance of mitochondria is severely impaired in PC keratinocytes. Although they are able to form autolysosomes, these structures were shown to accumulate in PC. Assessment of lysosomal function revealed defective enzymatic capacity and the mitochondrial overaging phenotype could be mimicked by lysosomal pH modifications in healthy cells. Thus, it can be concluded that the process of autolysosomal recycling, which is essential for macroautophagy, is impaired in PC, which results in impaired mitophagy. Overall, this work established new image analysis tools which allowed a detailed quantification of mutant keratin dynamics, and elucidated that mutant keratins modulate mitophagy and autolysosomal recycling in PC keratinocytes.

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