Community of niche-optimized strains : a novel concept for the biotechnological production of small molecules

Schito, Simone; Wiechert, Wolfgang; Büchs, Jochen

doi:10.18154/RWTH-2024-00279

Community of niche-optimized strains : a novel concept for the biotechnological production of small molecules = Gemeinschaften von Nischen-optimierten Stämmen : ein neues Konzept für die biotechnologische Produktion kleiner Moleküle

Schito, Simone^RWTH*

2023 & 2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Simone Schito

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2023

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2023

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2024

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH* ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2023-12-21

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-00279
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/976519/files/976519.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Projekte

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
ALE (frei) ; C. glutamicum (frei) ; arginine production (frei) ; evolutionary engineering (frei) ; genome reduction (frei) ; microbial communities (frei) ; synthetic cocultures (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Heutzutage werden in den meisten Fermentationsprozessen zur Herstellung von Plattform- und Feinchemikalien Reinkulturen von hochentwickelten mikrobiellen Modellorganismen mit flexiblen Stoffwechselkapazitäten verwendet. In einem Bioreaktor weisen diese Stämme jedoch durch eine hohe Expression ungenutzter Enzyme auf, die zu Kohlenstoff- und Energieverschwendung führen und dadurch die Prozesseffizienz beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu haben sich Mikroorganismen in der Natur im Laufe der Evolution in Gemeinschaften entwickelt und verfügen häufig über Auxotrophien. Dies lässt schlussfolgern, dass Co-kulturen mit schlankeren Genomen und Interaktion mittels Cross-Feeding erhebliche Vorteile gegenüber Reinkulturen von Organismen mit natürlicherweise größeren Genomen haben können. Um diese Hypothese zu erforschen und deren Potenzial für die Etablierung neuer Bioprozesse aufzuzeigen, wurde das Konzept der Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS) entwickelt und untersucht. Mit einem modellbasierten Ansatz wurden mehrere CoNoS kreiert, die aus Co-kulturen von mindestens zwei Stämmen derselben Spezies zusammengesetzt sind und jeweils eine andere Auxotrophie tragen. Während die Auxotrophien aufgrund der Deletion stark exprimierter Gene gewisse Kohlenstoff- und Energieeinsparungen ermöglichen, kompensiert das Cross-Feeding die Auxotrophien und trägt zur Schaffung einer definierten ökologischen Nische bei, in welcher die CoNoS die verfügbaren Ressourcen effizienter nutzen kann. Um die CoNoS zu etablieren, wurden auxotrophe Stämme von Corynebacterium glutamicum konstruiert und mittels rationalem Metabolic Engineering der Aminosäureaustausch zwischen den Mitgliedern der Gemeinschaft verbessert. Auf diese Weise wurde eine schnell wachsende Co-kultur etabliert, die eine Wachstumsrate von 83 % der entsprechenden Referenzmonokultur aufwies. Darüber hinaus war diese CoNoS nach einer anfänglichen Wachstumsphase in der Lage, eine der ausgetauschten Aminosäuren zu akkumulieren. Dies belegte die grundsätzliche Eignung des Konzeptes für die biotechnologische Produktion. Parallel dazu wurde ein automatisierter Ansatz der adaptiven Laborevolution angewendet, um das Wachstum einer ausgewählten CoNoS zu verbessern. Dabei wurde ein bisher nicht charakterisierter Transporter für L-Arginin entdeckt und mit ArgTUV annotiert. Außerdem erhöhte die Deletion von ArgTUV in einem L-Arginin-produzierenden Stamm die Endkonzentration dieses Zielprodukts. Schließlich wurde eine modulare Co-kultur mit einem Stamm konstruiert, der einen synthetischen Schalter trägt, um die relative Zusammensetzung der Gemeinschaft zu regulieren und die Kohlenstoffquellen effizienter in die Assimilation des gewünschten Produkts zu leiten. Die so erweiterte CoNoS wurde anschließend mit einem auf einer Monokultur basierenden Produktionsprozess im geregelten Bioreaktoransatz verglichen. Hierbei zeigte der CoNoS-Prozess eine mehr als doppelt so hohe Akkumulation von L-Arginin, was dessen Potenzial und Anwendbarkeit für die Entwicklung effizienterer Bioprozesse unterstreicht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der CoNoS-Ansatz für die Etablierung genomreduzierter Co-kulturen universell anwendbar ist. Auf diese Weise können nicht nur Energie- und Kohlenstoffquellen effizienter in die Biosynthese der gewünschten Produkte fließen, sondern es kann auch neues Wissen über die Plattformorganismen mittels Evolutions-geleitetem Metabolic Engineering generiert werden.

Nowadays, most fermentation processes for the production of platform and fine chemicals utilize pure cultures of highly engineered model microorganisms with flexible metabolic capacities. However, in a bioreactor environment, these strains are characterized by high expression of unused enzymes resulting in carbon and energy waste, thereby affecting process efficiency. In contrast, microorganisms in nature have evolved in communities and are often characterized by auxotrophies. This suggests that co-cultures with leaner genomes and interactions via cross-feeding must have significant advantages over pure cultures of organisms with naturally larger genomes.To explore this hypothesis and demonstrate its potential for establishing new bioprocesses, the concept of Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS) was developed and investigated. A model-based approach was used to create multiple CoNoS composed of co-cultures of at least two strains of the same species, each carrying a different auxotrophy. While the auxotrophies provide some carbon and energy savings due to the deletion of highly expressed genes, cross-feeding compensates for the auxotrophies and helps create a defined ecological niche in which the CoNoS can use available resources more efficiently. To establish the CoNoS, auxotrophic strains of Corynebacterium glutamicum were constructed, and rational metabolic engineering was applied to enhance amino acid exchange among community members. In this way, a fast-growing co-culture was established that exhibited a growth rate of 83% of the corresponding reference monoculture. Moreover, after an initial growth phase, this CoNoS was able to accumulate one of the exchanged amino acids. This demonstrated the general suitability for bio-based production. In parallel, an automated adaptive laboratory evolution approach was applied to improve the growth of selected CoNoS. In this experiment, a previously uncharacterized transporter for L-arginine was discovered and annotated with ArgTUV. In addition, the deletion of ArgTUV in an L-arginine-producing strain increased the final concentration of this target product. Finally, a modular coculture was constructed with a strain carrying a synthetic switch to regulate relative community composition and more efficiently direct carbon sources into the assimilation of the desired product. The advanced CoNoS was then compared to a monoculture-based production process under well-controlled bioreactor conditions. Here, the CoNoS process outperformed the monoculture showing a more than doubled L-arginine titer, highlighting its potential and applicability for the development of more efficient bioprocesses.In summary, this work demonstrated that the CoNoS approach is universally applicable to establishing genome-reduced co-cultures. In this way, not only can energy and carbon sources be more efficiently channeled into the biosynthesis of desired products, but also new knowledge about platform organisms can be generated using evolution-guided metabolic engineering.

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