Comprehensive analysis of the IRE1 interactome using turboID in the human mast cell leukemia cell line HMC-1.2

Ahmed, Nabil; Panstruga, Ralph; Huber, Michael; Weiskirchen, Ralf

doi:43787

Comprehensive analysis of the IRE1 interactome using turboID in the human mast cell leukemia cell line HMC-1.2

Ahmed, Nabil^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nabil Ahmed, Master of Science

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Huber, Michael (Thesis advisor)^RWTH* ; Weiskirchen, Ralf (Thesis advisor)^RWTH* ; Panstruga, Ralph (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-10-08

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-09585
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/994915/files/994915.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
IRE1 (frei) ; mast cell leukemia (frei) ; metadherin (frei) ; ubiquitination (frei) ; unfolded protein response (frei) ; valosin-containing protein (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Aufrechterhaltung der Protein-Homöostase unter Stressbedingungen ist essentiell für die Funktion von sekretorischen Zellen und das Wachstum von Tumorzellen. Treten im endoplasmatischen Retikulum (ER) fehlgefaltete Proteine auf, wird der Mechanismus der Unfolded Protein Response (UPR) aktiviert. Fehlgefaltete Proteine werden unter Beteiligung des Chaperons BIP von den drei ER-Stress-Sensoren IRE1, PERK und ATF4 erkannt, die dadurch aktiviert werden. Die ER-Stress-Sensoren initiieren die Bildung der Transkriptionsfaktoren XBP1s, ATF4 und ATF6. Die Zielgene dieser Transkriptionsfaktoren tragen dazu bei, die Proteostase wiederherzustellen und damit das Überleben der Zelle zu gewährleisten. Eine Verminderung von ER-Stress wird durch eine verstärkte Expression von Chaperonen, die Reduktion der Translation und die Einleitung von ER-assoziierten Abbauwegen erreicht. Im Gegensatz dazu, ist die UPR bei starkem oder dauerhaftem ER-Stress in der Lage Apoptose zu induzieren. Die Mastzellleukämie (MCL) ist die aggressivste Form der systemischen Mastozytose mit einer medianen Überlebenszeit von nur sechs Monaten nach der Diagnose. In der vorliegenden Arbeit wurde das Interaktom des ER-Stress-Sensors IRE1 in der Mastzellleukämie-Zelllinie HMC-1.2 untersucht. Abhängig von der Dauer oder der Stärke des auftretenden ER-Stresses werden Dimere oder Oligomere von IRE1α gebildet. Dies führt zur Aktivierung der beiden zytoplasmatischen Domänen, einer Kinase und einer RNase-Domäne. Beim Prozess des Spleißens entfernt die RNase-Domäne von IRE1 ein 26-Nukleotid-Intron aus der für den Transkriptionsfaktor XBP1 kodierenden mRNA (XBP1). Prozessiertes XBP1s initiiert die Transkription von entscheidenden Zielgenen des UPR. Neben der ubiquitär exprimierten Isoform IRE1α konnten wir in dieser Studie die Expression der zweiten Isoform, IRE1β, in den menschlichen Mastzelllinien HMC-1 und ROSA nachweisen. Die IRE1-Isoformen unterscheiden sich in der RNase-Domäne. Durch Analyse von IRE1β-defizienten HMC-1.2-Zellen konnten wir eine Beteiligung von IRE1β am Spleißen von XBP1 nachweisen. In der MCL-Zelllinie HMC-1.2 spielt IRE1α eine bedeutende Rolle für das Wachstum und Überleben der Zellen. Deshalb ist das Verständnis der Funktion IRE1-interagierender Proteine von besonderem Interesse. Zu diesem Zweck wurde eine Proteomanalyse von IRE1 in den HMC-1.2-Zellen durchgeführt, um IRE1α-regulierte Faktoren unter basalen oder ER-Stress Bedingungen zu identifizieren. Zunächst wurden Interaktionspartner mit Hilfe des verbesserten Protein-Biotin-Ligase-Systems TurboID markiert, aufgereinigt und mittels MS-Analyse identifiziert. Wir konnten Proteine nachweisen, die an dem vesikulären Transport, der Proteinstabilisierung und dem ubiquitinabhängigen ER-assoziierten Proteinabbau beteiligt sind. Interaktionen von IRE1α mit VAPA und Emerin, die möglicherweise auf Membrankontaktstellen zurückzuführen sind, sowie Interaktionen mit den Onkoproteinen MTDH und SND1, Mitgliedern des RISC-Komplexes, und der proteinabbauenden AAA-ATPase VCP wurden durch Co-Immunpräzipitation bestätigt. In HEK293-Zellen führte die Überexpression von VCP und IRE1α zu einer erhöhten Stabilität von IRE1α. Darüber hinaus charakterisierte diese Studie die Aminosäure T973 am C-Terminus von IRE1α. Wir konnten zeigen, dass die Mutation von T973 mit der Phosphorylierung von S724 in der Kinasedomäne von IRE1α unter ER-Stressbedingungen assoziiert ist.

The unfolded protein response (UPR) is essential for reducing the impact of misfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) of cells. Misfolded proteins are recognized by the chaperone BIP, which subsequently releases the three ER stress sensors IRE1, PERK, and ATF6, leading to their activation. These ER stress sensors initiate the production of transcription factors XBP1s, ATF4, and ATF6. The target genes of these transcription factors contribute to restoring proteostasis or induce apoptosis, depending on the cellular conditions. This is facilitated by enhancing the expression of chaperones, reducing translation, and initiating ER-associated degradation pathways. In cancer, the UPR plays a pivotal role in tumor development, progression, and resistance to therapy through its complex signaling networks. UPR is involved in multiple types of cancer, including Mast Cell Leukemia (MCL), which is characterized by a median survival time of only six months after diagnosis. In the presence of misfolded proteins, the ER stress sensor protein IRE1, forms dimers or oligomers and undergoes trans-autophosphorylation by its kinase domain, resulting in the activation of its RNase domain. The RNase domain of IRE1 initiates the removal of a 26-nucleotide intron from the mRNA encoding XBP1, a crucial transcription factor for UPR target genes. We could demonstrate the expression of the IRE1β isoform in the human mast cell lines HMC-1 and ROSA by RT-qPCR. In addition, XBP1 splicing was slightly reduced in IRE1β knockout cells, suggesting minor participation in XBP1 splicing. This strongly confirms the distinguishing function between IRE1α and IRE1β based on their RNase domain.IRE1α is essential for the proliferation and survival of the MCL cell line HMC-1.2, prompting further investigation into the identification of IRE1α interactors/regulators through proteomic analysis. For this purpose, proteomic analysis of IRE1 in the HMC-1.2 cells with and without ER stress condition was performed, and IRE1α-regulated factors were identified using the TurboID proximity labelling technique combined with MS-analysis. We could classify the function of the identified proteins using Gene Ontology (GO) and pathway enrichment analyses, which are implicated in vesicle-mediated transport, protein stabilization, and ubiquitin-dependent ER-associated protein degradation. IRE1α interactions with VAPA and Emerin potentially could be due to membrane contact sites. Interactions with the oncoproteins MTDH and SND1, members of the RISC complex, and the protein degradation-associated AAA ATPase VCP were confirmed via co-immunoprecipitation experiments. In HEK293 cells, the overexpression of VCP and IRE1α resulted in increased stability of IRE1α. Additionally, this study characterized the amino acid residue T973 at the C-terminus of IRE1α. We demonstrated that the mutation of T973 is associated with the phosphorylation of S724 in the kinase domain of IRE1α under ER stress conditions.

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