Development and implementation of a genome-wide CRISPR/Cas9 screen for identification of cellular factors affecting recombinant adeno-associated virus (rAAV) production

Hüllen, Fabian; Pradel, Gabriele; Huber, Michael; Scheer, Nico

doi:10.18154/RWTH-2024-10018

Development and implementation of a genome-wide CRISPR/Cas9 screen for identification of cellular factors affecting recombinant adeno-associated virus (rAAV) production

Hüllen, Fabian^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Fabian Jack Hüllen (Master of Science)

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Huber, Michael (Thesis advisor)^RWTH* ; Scheer, Nico (Thesis advisor) ; Pradel, Gabriele (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-08-28

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-10018
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/995603/files/995603.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
AAV (frei) ; Cas9 screening (frei) ; gene therapy (frei) ; stable cell line development (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Fortschritte in der Entwicklung gentherapeutischer Arzneimittel bieten eine große Chance zur Behandlung oder Heilung bisher unheilbarer Krankheiten. Rekombinante adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) sind dabei die vielversprechendsten Gentransfersysteme für die in vivo Gentherapien, wie zahlreiche kürzlich erteilte Zulassungen für rAAV-basierte Therapeutika zeigen. Trotz Vorteile wie geringe Immunogenität und die Fähigkeit zur langfristigen episomalen Expression, stellt die begrenzte Skalierbarkeit bestehender rAAV Produktionssysteme eine anhaltende Herausforderung dar. Zur Adressierung dieses Problems, haben wir eine Screening-Methode entwickelt, um zelluläre Gene zu identifizieren, die die rAAV Produktion in einer stabilen, Plasmid- und Helfervirus-unabhängigen rAAV Suspensionsverpackungs-Zelllinie unterstützen oder unterdrücken. Dazu haben wir eine innovative genomweite Lenti-AAV-CRISPR Plasmid Screening-Bibliothek (pLAC-Bibliothek) erstellt, die 68.563 einzigartige sgRNAs enthält. Diese Bibliothek wurde in einem ersten Schritt in lentivirale Partikel verpackt und anschließend für die Transduktion einer humanen, stabilem AAV-Verpackungszelllinie verwendet, die die für die konstitutive Expression von Cas9 angepasst wurde. Die von den transduzierten Verpackungszellen produzierten rAAVs wurden dann mittels Next-Generation-Sequenzierung analysiert. Dabei konnte eine Vielzahl von über- oder unterrepräsentierten sgRNAs identifiziert werden, die zu einer Inaktivierung von Genen mit vermutlich positivem oder negativem Einfluss auf die rAAV-Produktion führen. Um die Screening-Methode initial zu validieren, wurden ausgewählte Gene mit vermeintlich positivem Einfluss auf die rAAV Produktion durch Inaktivierung ausgewählt und in einzelnen rAAV-Verpackungszelllinien gezielt inaktiviert. Anschließend wurde ein AAV-Transfervektor mittels lentiviraler Transduktion in die Zellen integriert, um stabile rAAV-Produktionszelllinien zu erzeugen, was die Untersuchung der potentiellen Zielgene in einem vollständig stabilen und induzierbaren Produktionssystem ermöglichte. In einem zweiten Projekt haben wir die Produktionszellen zur Identifikation neuer Integrationsstellen für die gezielte und wiederverwendbare Integration von Transgenkassetten, für die starke und stabile Überexpression von Transgenen untersucht. Solche Integrationsstellen können z.B. für die Überexpression von zellulären Faktoren genutzt werden, die einen vorteilhaften Effekt auf die rAAV Produktivität haben. Die stabile Integration von Transgenen in Wirtszellen ist eine weit verbreitete Strategie für die Entwicklung von Zelllinien. Dies wird jedoch in der Regel durch zufällige Integration erreicht und erfordert ein sowohl arbeits- als auch zeitaufwendiges Verfahren, um stabile Klone mit hoher Expression zu identifizieren. Im Gegensatz dazu, ermöglicht die Verwendung eines charakterisierten chromosomalen Lokus eine wesentlich schnellere und zuverlässigere Generierung solcher Klone. Durch CRISPR/Cas9-vermittelte homologe Rekombination einer Reporterkassette konnten wir eine genomische Region unmittelbar stromabwärts des hochkonservierten ACTB-Lokus, der für Beta-Aktin kodiert, identifizieren. Um die relative Expressionsstärke im Vergleich zu anderen Loci zu bewerten, wurden zusätzliche Klone mit Einzelintegrationen durch zufällige Integration in einem ungerichteten Screening-Ansatz erzeugt. Dabei konnte eine erhöhte, über mehrere Passagen stabile Expression, durch Einzelintegrationen in dem ACTB-Lokus nachgewiesen werden. Dies konnte durch die anschließende Integration einer einzelnen C1-Esterase-Inhibitor-Expressionskassette bestätigt werden. Zusammenfassend ebnen die gezeigten Daten den Weg für die Entwicklung einer optimierten, vollständig skalierbaren rAAV-Produktionszelllinie. Die bisher untersuchten Targets zeigen großes Potenzial für die gezielte Optimierung der rAAV-Produktivität und darüber hinaus bieten die in dem Screening identifizierten über- oder unterrepräsentierten sgRNAs weitere Möglichkeiten zur Entdeckung vielversprechender Targets. Mit der Analyse der chromosomalen Region nahe des ACTB-Lokus konnten wir zudem die Grundlage für die gezielte Integration von Transgenen, wie z.B. für Genen mit positivem Einfluss auf die rAAV-Produktion, schaffen, um die weitere Optimierung zellulärer Produktionssysteme zu ermöglichen. Letztlich bieten sowohl die Screening-Methode als auch der beschriebene Locus mögliche Anwendungen für andere Zelllinien und Viren, was die Entwicklung auch über das AAV Feld hinweg interessant macht.

Advances in the development of gene therapy pharmaceuticals offer a great opportunity to treat or potentially cure previously untreatable diseases. Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) are emerging as the most promising gene delivery tools for in vivo gene therapies, as demonstrated by numerous recent approvals of rAAV-based therapeutics. Despite advantages such as low immunogenicity and the ability for long-term episomal expression, the limited scalability of existing rAAV production systems is a persistent challenge. To address this problem, we have developed a screening method to identify cellular genes that either supports or repress rAAV production in a fully stable, plasmid- and helper virus-free rAAV suspension packaging cell line. We created an innovative genome-wide Lenti-AAV-CRISPR plasmid screening library (pLAC library) containing 68,563 unique sgRNAs. After packaging this library into lentiviral particles, we transduced a human stable AAV packaging cell line, adapted for the constitutive expression of Cas9. The rAAVs produced by the transduced packaging cells were then analysed by next generation sequencing. This revealed a large number of over- or underrepresented sgRNAs, indicating that inactivation of the corresponding cellular genes had a positive or negative impact on rAAV production. To validate the screening method initially, genes with a putative positive impact on rAAV production were selected and inactivated in individual rAAV packaging cell lines. Subsequently, an AAV transfer vector was integrated into the cells by lentiviral transduction to generate stable rAAV production cell lines, which allowed the investigation of the potential target genes in a fully stable and inducible production system. In a second project, we have screened the AAV producer cells to identify novel integration sites for targeted and reusable integration of transgene cassettes enabling strong and stable overexpression. Such integration sites could be used, for example, to overexpress cellular genes which could have a potentially beneficial effect on rAAV production. Stable integration of transgenes into host cells is a widely used strategy for cell line development. Typically, this is accomplished through random transgene integration, requiring an elaborate and time-consuming screening process to identify clones with long-term stability and high expression levels. In contrast, utilizing a well-characterized chromosomal locus allows a much faster and reliable generation of such clones. Using CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of a reporter cassette, we identified a genomic region immediately downstream of the highly conserved ACTB locus encoding for actin beta. To assess the relative expression strength compared to other loci, additional clones with single copy integrations were generated in a non-targeted screening approach employing a random expression cassette integration. Analysis of different clones revealed relatively high expression of single copy transgene insertions into the ACTB locus, demonstrating stability over multiple passages. Subsequent single copy insertion of a C1 esterase inhibitor expression cassette into this site resulted in strong expression. In conclusion, the results pave the way for the development of an optimized, fully scalable rAAV production cell line. The targets investigated so far show great potential for the targeted optimization of rAAV productivity. In addition, the over- or under- represented sgRNAs identified in the screening provide further promising targets that still need to be investigated. With the identification of the region downstream of the ACTB locus, we have also created the basis for the targeted integration of transgenes such as genes with a positive influence on rAAV production, to optimize cellular production systems. Moreover, both the screening method and the described locus offer potential applications for other cell lines and viruses, which makes the development interesting beyond the AAV field.

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