Exploring cellular and molecular consequences of PROTAC-mediated ASH2L regulation in mouse embryonic fibroblasts

Sayadi Boroujeni, Roksaneh; Costa, Ivan G.; Lüscher, Bernhard

doi:10.18154/RWTH-2024-11077

Exploring cellular and molecular consequences of PROTAC-mediated ASH2L regulation in mouse embryonic fibroblasts

Sayadi Boroujeni, Roksaneh^RWTH*

2024 & 2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Roksaneh Sayadi Boroujeni, M. Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2025

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Lüscher, Bernhard (Thesis advisor)^RWTH* ; Costa, Ivan G. (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-11-20

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-11077
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/997118/files/997118.pdf

Einrichtungen

Projekte

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
chromatin (frei) ; epigenetics (frei) ; histone post-translational modifications (frei) ; molecular biology (frei) ; transcription (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In dieser Studie haben wir ein PROTAC-System (insbesondere dTAG) eingesetzt, um einen schnellen Abbau von ASH2L zu erreichen und so die Einschränkungen zu überwinden, die sich aus seiner langen Halbwertszeit ergeben, die normalerweise zu einem langsamen Rückgang des Proteins nach dem Knockout führt. Bei diesem Ansatz wird die Proteasom-Maschinerie der Zellen genutzt, um das betreffende Protein durch Ubiquitinierung des ASH2L-Fusionsproteins abzubauen. Dieser Prozess wurde durch eine heterobifunktionelle Verbindung (dTAG-13) erleichtert, die an den E3-Ligase-Substratrezeptor CRBN und eine mit dem ASH2L-Protein fusionierte abbaubare Domäne (FKBPF36V) bindet. Dies ermöglichte es uns, die unmittelbaren und direkten Folgen des ASH2L-Verlusts in immortalisierten embryonalen Maus-Fibroblasten (iMEFs) zu beobachten. Der rasche Abbau von ASH2L führte am zweiten Tag der dTAG-13-Behandlung zu einer erheblichen Hemmung der Zellproliferation, wobei die Zellen eine beeinträchtigte DNA-Synthese und eine Tendenz zur Akkumulation in der G1-Phase des Zellzyklus aufwiesen. Die Wiederherstellung des ASH2L-FKBP-Fusionsproteins kehrte diese Effekte um, was die wesentliche Rolle von ASH2L bei der Zellzyklusprogression unterstreicht. Nach dem Abbau von ASH2L und der ChIP-seq-Analyse beobachteten wir eine sequenzielle Abnahme von H3K4me3, einer Histonmarkierung, die mit aktiven Promotoren assoziiert ist und durch den ASH2L-enthaltenden Komplex KMT2 abgelagert wird. Die Halbwertszeit von H3K4me3 variierte zwischen verschiedenen Promotoren, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dem Verlust von ASH2L hinweist. Gleichzeitig gab es einen Anstieg von H3K4me1 an Promotoren und einen Rückgang an Enhancern und intergenen Regionen, was auf eine Anhäufung von H3K4me3-Demethylierungszwischenprodukten an Promotoren bzw. eine Umverteilung von monomethylierten Markierungen im restlichen Genom hindeutet. Die Histonmarkierungen H3K27ac und H3K27me3, die eng mit der H3K4-Methylierung verknüpft sind, waren jedoch mit erheblicher Verzögerung betroffen, was auf einen nachgeschalteten Effekt des ASH2L-Abbaus hinweist. Interessanterweise war die Transkription der naszierenden RNA durch den Verlust von H3K4me3 nicht unmittelbar betroffen. Es sind jedoch weitere Transkriptionsanalysen mit einer tieferen Sequenzierung erforderlich, um das Ausmaß der Auswirkungen des unmittelbaren Verlusts von ASH2L zu bestätigen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Transkriptionsmaschinerie gegen schnelle Veränderungen der Histonmethylierung gepuffert ist und die Transkriptionsstabilität kurzfristig aufrechterhält. Die gesamte RNA-Expression war jedoch in späteren Stadien nach dem Verlust von ASH2L dereguliert, was die letztendlichen Auswirkungen auf die Genexpression zeigt. Unsere Ergebnisse heben die geordneten, aber relativ langsamen nachgelagerten Effekte des ASH2L-Verlusts hervor, was darauf hindeutet, dass die Systeme, die die Gen-Transkription und die Chromatindynamik steuern, gut gepuffert sind. Der rasche Abbau von ASH2L löst eine Kaskade von Ereignissen aus, beginnend mit dem Abbau von H3K4me3, gefolgt von der Umverteilung von H3K4me1 und der Reduktion von H3K27ac, einer verzögerten Akkumulation von H3K27me3, was letztlich zu Veränderungen in der Chromatinstruktur und zur Deregulierung der Transkription führt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie neue Erkenntnisse über die Rolle von ASH2L und dem COMPASS/KMT2-Komplex bei der Regulierung von Histonmodifikationen und der Genexpression liefert. Das PROTAC-System erwies sich als leistungsfähiges Instrument zur Untersuchung der unmittelbaren Auswirkungen des Proteinverlusts und enthüllte die komplizierte und gepufferte Natur der epigenetischen Regulierung.

In this study, we utilized a PROTAC system (specifically dTAG) to achieve the rapid degradation of ASH2L, overcoming the limitations posed by its long half-life, which typically results in a slow decrease of the protein upon knockout. This approach harnesses the proteasome machinery of the cells to degrade the protein of interest through the ubiquitination of the ASH2L fusion protein. This process was facilitated by a heterobifunctional compound (called dTAG-13) binding to the E3 ligase substrate receptor, CRBN, and a degradable domain (FKBPF36V) fused to ASH2L protein. This allowed us to observe the immediate and direct consequences of ASH2L loss in immortalized mouse embryonic fibroblasts (iMEFs). Rapid degradation of ASH2L led to a significant inhibition of cell proliferation by day two of dTAG-13 treatment, with cells exhibiting compromised DNA synthesis and a tendency to accumulate in the G1 phase of the cell cycle one day post treatment. Restoration of the ASH2L-FKBP fusion protein reversed these effects, highlighting the essential role of ASH2L in cell cycle progression. Following ASH2L degradation and ChIP-seq analysis, we observed a sequential depletion of H3K4me3, a histone mark associated with active promoters and deposited by the ASH2L-containing complex, KMT2. The half-life of H3K4me3 varied between different promoters, indicating differential sensitivity to ASH2L loss. Concurrently, there was an increase in H3K4me1 at promoters and a decrease at enhancers and intergenic regions, suggesting an accumulation of intermediate H3K4me3 demethylation products at promoters and redistribution of monomethylated marks at the rest of the genome, respectively. However, histone marks H3K27ac and H3K27me3, which are closely linked to H3K4 methylation, were affected with a considerable delay, indicating a downstream effect of ASH2L degradation.Interestingly, nascent RNA transcription was not immediately affected by the loss of H3K4me3. However, further transcription analysis with more depth of sequencing will be needed to confirm the extent of the effect of immediate loss of ASH2L. Overall, these findings imply that the transcriptional machinery is buffered against rapid changes in histone methylation, maintaining transcriptional stability in the short term. However, overall RNA expression was deregulated at later stages post-ASH2L loss, demonstrating the eventual impact on gene expression. Our findings highlight the ordered but relatively slow downstream effects of ASH2L loss, suggesting that the systems controlling gene transcription and chromatin dynamics are well-buffered. The rapid degradation of ASH2L initiates a cascade of events starting with H3K4me3 depletion, followed by H3K4me1 redistribution and H3K27ac reduction, delayed H3K27me3 accumulation, leading to changes in chromatin structure and transcriptional deregulation. In conclusion, this study provides new insights into the role of ASH2L and the COMPASS/KMT2 complex in regulating histone modifications and gene expression. The PROTAC system proved to be a powerful tool for dissecting the immediate effects of protein loss, revealing the intricate and buffered nature of epigenetic regulation.

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