Exploration of fermentation strategies for triterpenoid production in Saccharomyces cerevisiae

Gilani, Mariam Dianat Sabet; Blank, Lars M.; Ebert, Birgitta Elisabeth

doi:44019

Exploration of fermentation strategies for triterpenoid production in Saccharomyces cerevisiae

Gilani, Mariam Dianat Sabet^RWTH*

2024 & 2025

VerantwortlichkeitsangabeMariam Dianat Sabet Gilani

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

ISBN978-3-98555-246-7

ReiheApplied microbiology ; 37

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Druckausgabe: 2024. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2025. - Weitere Reihe: Edition Wissenschaft Apprimus

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Ebert, Birgitta Elisabeth (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-08-13

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-00566
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1002602/files/1002602.pdf

Einrichtungen

Projekte

Maßgeschneiderte Inhaltsstoffe - Verbundvorhaben: Prozess-gerichtete Produktion von Wirkstoffen in Hefe Teilvorhaben 2: Systembiotechnologie der Hefe (031B0356B) (031B0356B)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Triterpenoide sind eine vielfältige Gruppe pflanzlicher Sekundärmetabolite, die in der traditionellen Medizin als antibakterielle, antivirale und entzündungshemmende Agenzien angewendet werden, und potentielle Kandidaten für die Anwendung in der Pharma-, Kosmetik- und Nahrungsindustrie sind. Die Anwendung mikrobieller Zellfabriken für die Produktion von Triterpenoiden zeigt sich als eine vielversprechende Alternative zu den bestehenden komplexen mit niedriger-Ausbeute verbundenen und umweltschädlichen Prozessen. Bislang befinden sich die meisten Studien an Triterpenoid-Produktion noch in der Anfangsphase und zeigen einen Bedarf an weiterer Entwicklung zu einer wirtschaftlichen Produktion im großen Maßstab. Ein erfolgreicher mikrobieller Produktionsprozess ist das Ergebnis aus den beiden Gebieten der Metabolic Engineering und der Prozessoptimierung. Der Fokus dieser Dissertation liegt darin, Einblicke in die Zellleistung unter Produktionsbedingungen für einen optimalen Prozessdesign zu erhalten. Hier wurde spezifisch die heterologe Triterpenoidproduktion in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) an dem Beispiel von Lupane-artigen pentazyklischen Triterpenoiden untersucht. Zunächst wurde eine nicht-invasive Überwachungsmethode mittels nicht-linearer mikroskopischer Techniken entwickelt. Im Rahmen einer Grundsatzbeweis-Studie konnte gezeigt werden, dass eine Kombination der Coherent Anti-Stokes Raman scattering (CARS) und Second-Harmonic-Generation (SHG) Techniken für eine nicht-invasive Überwachung der Triterpenoidsynthese in immobilisierte Hefezellen und in wachsenden Zellen in einer Standkultur angewandt werden können. Das SHG Signal in Triterpenoid produzierenden Stämmen war signifikant höher als in dem nicht produzierenden Referenzstamm. Dies war in Korrelation mit dem lipophilen Gehalt, welches durch die klassische Methode der Nilrotfärbung bestimmt wurde. In wachsenden Kulturen zeigten beide Signale der CARS und SHG Änderungen über die Zeit, was neue Einblicke in der Dynamik der Triterpenoid Produktion und Speicherung in der rekombinanten Zelle erlaubte. Bislang sind keine Transporter für Triterpenoide in S. cerevisiae bekannt. Die intrazelluläre Akkumulation der Triterpenoide limitiert die Produktionskapazität einzelner Biokatalysatorzellen. Zusätzlich führt die intrazelluläre Akkumulation der Triterpenoide zu dem Bedarf an einer Zellaufschlussmethode in der nachfolgenden Produktaufarbeitung, was eine zusätzliche Komplikation und den Verlust der Biokatalysatorzellen mit sich bringt. Um diese Herausforderung anzugehen, wurde zweitens eine in situ Extraktionsmethode evaluiert, die eine Extraktion der Triterpenoiden aus lebendigen Zellen ermöglicht. Anhand eines Lösungsmittelscreenings basiert auf die Kriterien der Triterpenoid Löslichkeit, Biokompatibilität und Umweltfreundlichkeit und anschließender Untersuchungen an den potenziellen Einflüssen des Lösungsmittels auf der Hefephysiologie und Viabilität, wurde Isopropyl Myristat (IPM) als ein geeignetes Lösungsmittel vorgeschlagen. In einem Experiment mit der Zugabe frischen IPMs am Ende von jeder Batchrunde wurde eine signifikant höhere Triterpenoid Produktion im Vergleich zu einer Kontrolle ohne IPM Zugabe beobachtet. Zusätzlich zu IPM-Zugabe wurde auch ein positiver Einfluss von Zugabe von Cyclodextrinen (CD) beobachtet. Diese entwickelte Extraktionsmethode wurde anschließend erfolgreich in einer Fed-batch Kultivierung in Bioreaktor angewandt, wo die Möglichkeit der Anwendung einer in-situ Extraktion ohne Beeinträchtigung der Zellviabilität gezeigt werden konnte. Als drittes wurde Glukose als Kohlenstoffquelle für Triterpenoidsynthese erneut untersucht. Es wurde die Produktivität von drei Triterpenoid produzierenden Stämmen auf Glukose verglichen. Dies erfolgte durch die Durchführung einer Glukose-limitierten Fed-batch Kultivierung in Schüttelkolben. Diese Dissertation trägt zu neuen analytischen Methoden, eine Vereinfachung der Produktaufreinigung, und potentiell eine rapide Produktion auf dem Hauptkohlenstoffquelle in der Biotechnologie, Glukose, bei. Die mit Triterpenoiden verbundenen Möglichkeiten scheinen unendlich groß zu sein und die in dieser Arbeit angestrebte Produktion mit niedrigeren Kosten wird zukünftige Fortschritte erleichtern.

Triterpenoids are a diverse group of plant-derived secondary metabolites, which have been used in traditional medicine as antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory agents, and show potential for application in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. The application of microbial factories for the production of triterpenoids is shown to be a promising alternative to the existing low-yield, complex, and environmentally-affecting processes. Up to now, most studies on triterpenoid production are still ongoing and need to be further developed to be economically feasible for large-scale production. A successfully achieved microbial process is the result of both metabolic and process engineering. The focus of this thesis is gaining insights into cell performance under production conditions for optimal process design. Specifically, the heterologous production of triterpenoids in Saccharomyces cerevisiae is investigated on the example of lupane-type pentacyclic triterpenoids. First, non-invasive monitoring of triterpenoid synthesis by non-linear microscopy was developed. Within a proof-of-principle study, it could be shown that the combination of coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and second-harmonic-generation (SHG) microscopy techniques can be applied for monitoring of triterpenoid synthesis in both fixed yeast cells and cells growing in liquid culture. The SHG signal in triterpenoid-producing strains was significantly higher than in a non-producing reference strain, correlating with lipophile content as determined by classical Nile red staining. In growing cultures, both CARS and SHG signals changed over time, enabling new insights into the dynamics of triterpenoid production and storage by recombinant yeast. Up to this date, no transporters for triterpenoids in S. cerevisiae are known. The intracellular accumulation of triterpenoids limits the production capacity of the yeast. Moreover, intracellular accumulation of triterpenoids leads to the necessity of cell disruption in the downstream process (DSP). To address this challenge, second, an in situ extraction method allowing the extraction of intracellular triterpenoids from living cells was evaluated. A solvent screening based on the criteria of triterpenoid solubility, biocompatibility, and environmental impact, followed by solvent testing on yeast physiology and viability suggested isopropyl myristate (IPM) as a suitable solvent. In an experiment, where fresh IPM was added at the end of each batch, a significantly higher triterpenoid production was observed compared to a control group without IPM addition. In addition to IPM, also the effect of cyclodextrins (CD) on product secretion from the cells was shown to be effective. Subsequently, the developed extraction method was applied successfully in fed-batch experiments in a bioreactor, showing the possibility of in situ extraction of intracellular products without affecting cell viability. Third, glucose as carbon source for triterpenoid synthesis was revisited. The productivities of three triterpenoid-producing strains on glucose were compared. This was realized by glucose-limited fed-batch cultivations in shake flask. The thesis contributes novel analytical ideas, DSP simplification, and potentially a rapid production on the main biotech carbon source, glucose. The opportunities for triterpenoids seem endless, while the here envisaged lower cost production will facilitate future advances.

OpenAccess:
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