Development of novel electrochemical aptamer biosensors for point-of-care glycemic control

Zhou, Lei; Herrmann, Andreas; Offenhäusser, Andreas

doi:HT031033404

Development of novel electrochemical aptamer biosensors for point-of-care glycemic control

Zhou, Lei^RWTH*

2024 & 2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science in Analytical Chemistry Lei Zhou

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2025

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Herrmann, Andreas (Thesis advisor)^RWTH* ; Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-12-17

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-03678
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/1009798/files/1009798.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Diabetes mellitus ist eine Krankheit, die hauptsächlich durch Insulinmangel und/oder Insulinresistenz verursacht wird, die verschiedene Komplikationen verursachen und die Lebensqualität der Patienten erheblich beeinträchtigen kann. Die Diagnose dieser Krankheit in einem frühen Stadium ist nicht nur für die Diabetesüberwachung, sondern auch für dessen Behandlung von Vorteil. Die akute und langfristige Blutzuckerkontrolle bei Diabetes-Patienten beruht üblicherweise auf der Beurteilung des Blutzuckerspiegels bzw. des glykierten Hämoglobins A1C (HbA1C). Glykiertes Humanserumalbumin (GHSA) kann als Alternative zu HbA1C angesehen werden, da dessen Lebensdauer viermal kürzer und die Konzentration im Blut unabhängig von hämischen Erkrankungen ist. Darüber hinaus ist der Insulinspiegel auch ein wichtiger Faktor für die Diabetesüberwachung, weshalb die Bestimmung der Insulinkonzentration von entscheidender Bedeutung ist. Obwohl die Bestimmung des Blutzuckerspiegels fundamental ist, besteht auch eine große Notwendigkeit für die Bestimmung von Insulin und GHSA. In dieser Arbeit sollen Aptamer-basierte elektrochemische Sensorplattformen etablieren werden, um Insulin- und GHSA-Biomarker mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit zu erkennen. Zunächst wurde ein ratiometrischer elektrochemischer Aptasensor unter Verwendung von Goldstabelektroden zur Insulindetektion vorgeschlagen. Anschließend wurden die Goldstabelektroden ebenfalls zur Bestimmung von Humanserumalbumin (HSA) bzw. GHSA verwendet. Schließlich wurde der HSA- und GHSA-Assay auf einen flexiblen Polymer-MEAs-Chip übertragen, um den gleichzeitigen Nachweis der beiden Biomarker zu ermöglichen. Zunächst wird ein ratiometrischer, elektrochemischer Aptasensor vorgeschlagen, der mit Hilfe der Square-Wave Voltammetrie (SWV) und einer Goldstabelektrode Insulin als Diabetes-Biomarker detektiert. Die Elektrode wurde mit einem Insulin Aptamer funktionalisiert, an den ein teilweise komplementärer ssDNA-Stang hybridisiert war. Der Aptamer wurde mit dem Redox-Tags Anthrachinon (AQ) und die hybridisierte ssDNA mit Methylenblau (MB) modifiziert, sodass ein Tag weit entfernt und der andere nahe der Goldoberfläche positioniert war. Darüber hinaus wurde der Aptamer durch doppelte Dithiol-Phosphoramidit ((DTPA)2) Gruppen auf der Goldoberfläche gebunden, wodurch eine deutlich höhere Haltbarkeit des Aptasensors erreicht werden kann. Als Blockierungsmolekül wurde monofunktionelles Methoxypolyethylenglykolthiol (PEG) verwendet, um die Goldoberfläche, die nicht mit Aptamermolekülen dekoriert war, zu passivieren. Während des Nachweises von Insulin wird der ssDNA-Strang vom Aptamer dehybridisiet, was zur Bildung einer typischen G-Quadruplex-Struktur während der spezifischen Bindung von Insulin führt. Dies resultiert in einen erhöhten AQ-Strom und einer Verringerung des MB-Stroms, die beide jeweils zur Bestimmung der Insulinkonzentration genutzt werden können. Der Herstellungsprozess sowie die Analytbindung dieses Aptasensors wurden durch verschiedene Untersuchungsmethoden wie Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipation (QCM-D), Rasterkraftmikroskopie (AFM), elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) und zyklische Voltammetrie charakterisiert. Die optimale Aptamerkonzentration und Analytinkubationszeit wurden nacheinander durch SWV-Messungen ermittelt und in allen weiteren Tests verwendet. Die Zuverlässigkeit dies entwickelten Aptasensors wurde zusätzlich durch die Etablierung eines UND-Logikgatter verbessert, bei dem das erhaltene Stromsignal nur dann vertrauenswürdig ist, wenn sowohl AQ- als auch MB-induzierte Signale von Null verschieden sind. Folglich verfügt dieser Insulin-Dual-Signal-Aptasensor über eine niedrige Nachweisgrenze von nur 0,15 nM und einen Nachweisbereich von 0,5 nM – 2,5 μM, was für die PoC-Diagnose vielversprechend ist. Anschließend wurde die Goldstabelektrode ebenfalls verwendet, um einen weiteren Aptasensor für Diabestesbiomarker, nämlich HSA- und GHSA zu etablieren. Dementsprechend wurden HSA- und GHSA-Aptamere angewendet. Als Blockierungsmolekül wurde hier 6-Mercapto-1-hexanol (MCH) verwendet. Der Entwicklungsprozess und die Analytbindung wurden auch in diesem Beispiel mit AFM- und EIS-Techniken charakterisiert, gefolgt von der Optimierung der experimentellen Bedingungen, einschließlich der Aptamerkonzentration sowie der Inkubationszeit des Analyten. Anschließend wurde der Nachweis von HSA und GHSA von den Goldstabelektroden auf flexible Multielektrodenfelder (flex⎯MEAs) übertragen, was die Immobilisierung der jeweiligen Aptamerrezeptoren erleichterte. MCH wurde durch PEG- Blockierungsmoleküle ersetzt, was sich positiv auf die Reduzierung der unspezifischen Adsorption bei der Detektion echter Blutproben auswirkt. Die Verwendung des Polymerchips erlaubt die Detektion beider Analyte in derselben Probe und führt zudem zu einer Kostenreduzierung. In dieser Arbeit verfügt der flex⎯MEA-Polymerchip über zwei Sätze von Goldelektroden, die unabhängig voneinander mit den jeweiligen Aptamerrezeptoren dekoriert werden können. Daher ist dieser elektrochemische Aptasensor in der Lage, gleichzeitig die Biomarker HSA und GHSA zu erkennen. In dieser Arbeit verfügt die etablierte Dual-Target-Aptasensing-Plattform über Nachweisgrenzen von 13 nM bzw. 25 nM für HSA und GHSA, in Kombination von einem dynamischen Nachweisbereich von 40 nM – 10 μM, der die klinisch relevanten Konzentrationen abdeckt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl der Insulin- als auch der HSA-Aptasensor (GHSA) eine hohe Selektivität, Haltbarkeit, Empfindlichkeit und ist in der Lage, die Analyten in realen Blutproben nachzuweisen. Die Entwicklung der Aptasensor erfolgten unter Verwendung unterschiedlicher Untersuchungsmethoden wie der elektrochemischen Impedanzspektroskopie, dem zyklischen Voltammogramm, der Rasterkraftmikroskopie, der Chronocoulometrie, der Square-Wave Voltammetrie, der Differentialimpulsvoltammetrie und der Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung zur selektiven Quantifizierung seines Analyten in verdünnten realen Blutproben. In der Zukunft könnten die hier vorgeschlagenen Aptasensoren auf einem flex⎯MEA-Polymerchip kombiniert und alle drei Analyten gleichzeitig und quantitativ erfasst werden, um eine zuverlässige und kostengünstige Kontrolle der Glykämie am PoC zu ermöglichen. Zudem könnten weitere Biomarker einbezogen werden, sodass eine vollständigere und umfassendere glykämische Überwachung realistisch wird.

Diabetes mellitus is a disease mainly induced by insulin deficiency and/or insulin resistance, which can cause several complications and seriously reduce the life quality of patients. The early-stage diagnosis of this disease is beneficial not only to diabetes monitoring but also to treatment evaluation. The acute and long-term glycemic control for diabetes patients commonly rely on the assessment of the levels of blood glucose and glycated hemoglobin A1C (HbA1C), respectively. Glycated human serum albumin (GHSA) can be considered an alternative to HbA1C, its lifespan is four times shorter and its concentration in blood is independent of hemic diseases. Besides, the insulin level of patients is also an important factor for diabetes monitoring through glucose metabolism control, thus it is crucial to determine the insulin concentration. Although it is important to assess the blood glucose level, there is also a huge necessity for insulin and GHSA determination. In this thesis, we aim to establish aptamer-based electrochemical sensing platforms to detect insulin and GHSA biomarkers in high selectivity and sensitivity. Firstly, a ratiometric electrochemical aptasensor was proposed by using gold rod electrodes for insulin detection, then the gold rod electrodes were used again for the determination of human serum albumin (HSA) and GHSA, respectively. Finally, the HSA and GHSA detection were transferred from the gold rod electrode to a flexible polymer-MEAs chip to facilitate the dual-detection of the two biomarkers. Firstly, a ratiometric electrochemical aptasensor is proposed to recognize the insulin biomarker by square wave voltammetry (SWV) measurement with a gold rod electrode, which was immobilized with insulin-capturing aptamer in hybridization with partially complementary ssDNA. The capturing aptamer and hybridized ssDNA were modified with redox tags of anthraquinone (AQ) and methylene blue (MB) at the side either far or close to the gold surface, respectively. Moreover, the capturing aptamer was self-assembled on the gold surface through functional groups of double dithiol-phosphoramidite ((DTPA)2) thus a considerably superior aptasensor durability can be obtained. Monofunctional methoxy-polyethylene glycol thiol (PEG) was used as a blocking material to passivate the gold surface undecorated by aptamer molecules. The detection of insulin biomarkers can cause the ssDNA dehybridization from the capturing aptamer which leads to the formation of a typical G-quadruplex structure during the specific binding of insulin. Therefore, the target detection results in an increased AQ current and decreased MB current, both of which can be utilized to evaluate the insulin concentration. The fabrication process as well as the target binding of this aptasensor were characterized by different physical or chemical techniques such as quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D), atomic force microscopy (AFM), electrochemical impedance spectroscopy (EIS), and cyclic voltammetry (CV). The optimal aptamer concentration and target incubation time were sequentially obtained by SWV measurements and used in all further tests. Then, the reliability of this aptasensor could be further improved by operating an AND logic gate, in which the obtained current signal only makes sense when both AQ and MB-induced signals are different from zero. Consequently, this insulin dual-signal aptasensor possesses a comprehensive detection limit as low as 0.15 nM and a detection range of 0.5 nM - 2.5 µM, which is promising for the PoC diagnosis.Then, the gold rod electrode was further employed to establish another electrochemical aptasensor for either HSA or GHSA detection. HSA aptamer and GHSA aptamer were accordingly applied. The commonly used blocking material of 6-mercapto-1-hexanol (MCH) was utilized as backfills. The aptasensor production and target binding processes were also characterized with AFM and EIS techniques, followed by the optimization of the experimental conditions including the aptamer concentration as well as the incubation time of targets. Afterwards, the detection of HSA and GHSA were all transferred from gold rod electrodes to the flexible multielectrode arrays (flex⎯MEAs) facilitating the immobilization of respective aptamer receptors. MCH was replaced with PEG backfills which is beneficial to reduce the unspecific adsorption in real blood sample detection. Therefore, the polymer chip is promising for the detection of the two biomarkers only in one mixed sample combined with the cost analysis. In this work, the flex⎯MEAs polymer chip contains two individual sets of gold electrodes, which are independently decorated with respective aptamer receptors. Therefore, this electrochemical aptasensor is capable of simultaneously detecting the HSA and GHSA biomarkers. In this work, the established dual-target aptasensing platform has detection limits of 13 nM and 25 nM for HSA and GHSA, respectively, followed by a comprehensive dynamic detection range of 40 nM - 10 µM, covering the clinically required concentrations.In summary, both the insulin and HSA (GHSA) aptasensors exhibit high selectivity, durability, sensitivity as well as real blood sample detection performance. Benefited from several techniques such as electrochemical impedance spectroscopy, cyclic voltammogram, atomic force microscopy, chronocoulometry, square wave voltammetry, differential pulse voltammetry, and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring, the insulin aptasensor for selective quantification of its analyte in diluted real blood samples, in combination with the simultaneous and quantitative detection of HSA and GHSA ratios in concentration, allows a reliable and cheap long-term glycemia control in PoC. Thus, more biomarkers can be included so that a more complete and comprehensive inspection of the glycemic surveillance becomes realistic.

OpenAccess:
PDF
(zusätzliche Dateien)