Identifying nucleoside and nucleotide protein interactions with S-adenosyl-L-homocysteine and adenosine triphosphate capture compounds

Krasova, Alina; Weinhold, Elmar

doi:999910310775

Identifying nucleoside and nucleotide protein interactions with S-adenosyl-L-homocysteine and adenosine triphosphate capture compounds = Identifizierung von Nucleosid- und Nucleotid–Protein-Wechselwirkungen mit S-Adenosyl-L-homocystein- und Adenosintriphosphat-Fängerverbindungen

Krasova, Alina

2012 & 2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Alina Krasova

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

UmfangVII, 120 S. : Il.., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012

Prüfungsjahr: 2012. - Publikationsjahr: 2013

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-12-21

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-44201
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/211798/files/4420.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Proteomanalyse (Genormte SW) ; Click-Chemie (Genormte SW) ; Methyltransferasen (Genormte SW) ; ATP (Genormte SW) ; Adenosylmethionin (Genormte SW) ; Organische Synthese (Genormte SW) ; Photochemie (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; proteomics (frei) ; click chemistry (frei) ; methyltransferases (frei) ; organic synthesis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Das Ziel der aktuellen Arbeit ist ein Beitrag zur Proteomforschung, also zur vollständigen Charakterisierung aller Proteine, die von Genom kodiert und in der Zelle exprimiert werden. In dieser Arbeit wird eine Methode der funktionalen Proteomforschung angewendet, und zwar die Capture Compound Mass Spectrometry™. Diese Methode verwendet kleine, synthetische, trifunktionelle Moleküle (Fängerverbindungen oder capture compounds) zur funktionellen Isolierung und Identifizierung bestimmter Enzymklassen. Eine capture compound (CC) besitzt a) eine Selektivitätsfunktion (z.B. Substrat oder Inhibitor des Zielenzyms) zur gezielten Erkennung des aktiven Zentrums des Proteins, b) eine Reaktivitätsfunktion (einen Photocrosslinker) zur kovalenten Bindung an das Zielprotein unter UV-Bestrahlung, und c) eine Isolierfunktion (z.B. Biotin) für die Isolierung des kovalent gebundenen Proteins. Nach der Isolierung können die Proteine mit Hilfe von SDS-PAGE analysiert oder durch LC-MS/MS identifiziert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden CCs entworfen und/oder angewendet, um zwei wichtige Familien von Enzymen zu erkennen: Methyltransferasen (MTasen) und ATP-bindende Proteine (ABPs). Die CC für die Isolierung von MTasen besaß S-Adenosyl-L-homocystein als Selektivitätsfunktion, Phenylazid als Reaktivitätsfunktion und ein terminales Alkin als chemischen Griff. An letztere konnte – nach dem UV-Photocrosslinking-Schritt – die Isolierfunktion angefügt werden, und zwar mit Hilfe der Click-Chemie. Als Click-Reaktion wurde die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin (3+2)-Cycloaddition eingesetzt. Die Fähigkeit dieser Click-SAH CC, die Methyltransferase M.Taq.I zu fangen, wurde erfolgreich überprüft. Verschiedene Bedienungen des Capture-Prozesses, z.B. die Detektionsmethode (Fluoreszenz oder Isolierung mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Beads), die Länge des „Isolierungslinkers“, sowie die Bedinungen für die Cycloaddition wurden optimiert. Im zweiten Projekt wurde eine Reihe von gamma-ATP CCs zur Isolierung von Nucleosid-Kinasen und anderen ABPs erprobt. Der Unterschied zwischen diesen CCs lag in der Reaktivitätsfunktion (Phenylazid, Tetrafluorphenylazid oder Trifluoromethyldiazirin) und auch in der Struktur des Linkers zwischen ATP und dem Rest des Moleküls. gamma-ATP CCs zeigten sehr unterschiedliche Profile gegenüber gereinigten Nucleosid-Kinasen und gegenüber ABPs aus E. coli-Lysat. Aus letzterem wurden 62 ABPs spezifisch isoliert, darunter bekannte ATP-bindende Proteine, aber auch vier uncharakterisierte Proteine, Thymidylat-Kinase (auch in gereinigter Form) sowie das universelle Stress-Protein D, das zuvor nicht als ATP-bindendes Protein bekannt war.

The current work aims to contribute to the proteome research, which means the ultimate characterization of all proteins that are encoded by the genome and expressed in the cell. The work described in this thesis utilizes a method of functional proteomics, called Capture Compound Mass Spectrometry™. In this method, small synthetic trifunctional molecules are used as chemical probes for functional isolation and identification of certain classes of enzymes. A capture compound (CC) has a) a selectivity function (e.g., enzyme substrate or inhibitor) for specific targeting the active site of an enzyme, b) a reactivity function (a photo-crosslinker) for covalent attachment to the protein under UV light, and c) a sorting function (e.g., biotin) for isolation of the captured protein. This makes it possible to analyze these proteins with SDS-PAGE or identify them via LC-MS/MS. In the present work, CCs were designed and/or applied to target two important enzyme families: methyltransferases (MTases) and ATP-binding proteins (ABPs). The CC for MTase isolation had S-Adenosyl-L-homocysteine as selectivity function, a phenyl azide as reactivity function and a terminal alkyne as a chemical handle for the sorting function. The latter could be attached to the CC after the UV photo-crosslinking via Click chemistry. As a Click reaction, the copper-catalyzed 1,3-dipolar azide-alkyne cycloaddition was used. The Click-SAH CC was successfully tested for its ability to capture the MTase MTaq.I. Various conditions of the capture process, such as detection method (fluorescence or streptavidin beads isolation), the length of the “sorting linker”, as well as the cycloaddition conditions, were optimized. In the second project, a series of gamma-ATP CCs for isolation of nucleoside kinases and other ABPs were tested. The CCs differed in terms of reactivity functions (phenyl azide, tetrafluorinated phenyl azide and trifluoromethyl diazirine) and the structure of the linker between the ATP and the rest of the molecule. The gamma-ATP CCs showed very different profiles towards the purified nucleoside kinases and towards the ABPs from E. coli lysate. From E. coli lysate, 62 ABPs were specifically isolated, among them known ATP-binders, but also as four uncharacterized proteins, thymidylate kinase (also captured in purified form) and Universal stress protein D, which was not known to be ATP-binding before.

Fulltext:
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