Improving the therapeutic potential of human granzyme B and evaluation of granzyme M as novel effector molecules in cytolytic fusion proteins for the treatment of Serpin B9-positive cancer

Schiffer, Sonja; Fischer, Rainer

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-48915

Improving the therapeutic potential of human granzyme B and evaluation of granzyme M as novel effector molecules in cytolytic fusion proteins for the treatment of Serpin B9-positive cancer = Verbesserung des therapeutischen Potentials von humanem Granzym B und Evaluierung von Granzym M als neue Effektormoleküle in zytolytischen Fusionsproteinen für die Behandlung von Serpin B9-positivem Krebs

Schiffer, Sonja (Author)

2013 & 2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sonja Schiffer, geb. Hermes

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangVI, 123 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Prüfungsjahr: 2013. - Publikationsjahr: 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-11-29

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-48915
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/229137/files/4891.pdf

Einrichtungen

RWTH Aachen (hsbk000000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Immunotoxin (Genormte SW) ; Rekombinantes Protein (Genormte SW) ; Leukämie (Genormte SW) ; Hodgkin (Genormte SW) ; Lymphom (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Krebstherapie (frei) ; Granzym B (frei) ; Granzym M (frei) ; Serpin B9 (frei) ; cytolytic fusion protein (frei) ; immunotherapy (frei) ; granzyme B (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Krebsbehandlungen sind häufig unspezifisch, so dass gesunde Zellen ebenfalls abgetötet werden. Um die Spezifität der Krebsbehandlungen zu verbessern, sind in den letzten Jahren vermehrt rekombinante chimäre Proteine entwickelt worden, z.B. Immuntoxine. Diese Konstrukte bestehen aus einer tumorspezifischen Bindedomäne (Antikörper oder Antikörper-Derivat) und einem pro-apoptotischen Protein (bakteriell oder pflanzlich). Um eine Immunogenität zu umgehen wird der Fokus nun auf die Entwicklung vollständig humaner zytolytischer Fusionsproteine gelegt. Diese Konstrukte haben eine humane zytotoxischen Kompontente um die Zielzellen abzutöten. Am vielversprechendsten sind hierbei Granzyme, die innerhalb der normalen Immunantwort eine wichtige Rolle spielen. Das am meist untersuchte Granzym ist Granzym B. Der Nachteil von Granzym B ist jedoch, dass seine enzymatische Aktivität durch die irreversible Inhibierung durch Serpin B9 limitiert ist. Serpin B9 wird im Zytosol von zytotoxischen Immunzellen mit Granzym B ko-exprimiert um die Wirkung von fehlgeleitetem Granzym B zu unterdrücken. In den letzten Jahren wurde die Expression von Serpin B9 ebenfalls innerhalb verschiedener Tumorzellen beschrieben, z.B. bei Brustkrebs, akuter Leukämie, Hodgkin Lymphom usw. Da eine hohe Anzahl an Serpin B9 positiven Tumorzellen zu einer verschlechterten klinischen Prognose führt, wird vermutet, dass gerade diese Zellen positiv selektiert werden und die natürliche Immunantwort umgehen können. Das gezielte Abtöten dieser Behandlungs-resistenten Zellen kann somit den therapeutischen Effekt und die Lebenserwartungen erheblich verbessern. Folglich war das Ziel dieser Arbeit neue humane zytolytische Fusionsproteine zu entwickeln, die in der Lage sind auch Serpin B9-positive Zielzellen abzutöten. Um dieses Ziel zu erreichen wurde zum Einen eine Variante von Granzym B generiert, die gegen die Inhibierung durch Serpin B9 resistent war. Um die für die Bindung zwischen Serpin B9 und Granzym B wichtigen Aminosäuren zu identifizieren wurden in silico Modellierungen durchgeführt (in Kooperation mit der „German Research School“ in Jülich, Prof. Carloni). Diese identifizierten Aminosäuren wurden entsprechend mutiert und die modifizierten Granzym B Varianten dann an die CD64-spezischen (hoch-affiner Rezeptor für IgG:Fc gammaRI, überexprimiert auf z.B. AML Zellen) bzw. CD30-spezifischen (Zellmembranprotein der Tumornekrosefamilie, überexprimiert auf z.B. Hodgkin Lymphomzellen) „single chain“-Fragmente der variablen Regionen (scFv) H22 bzw. Ki4. Die neuen Mutanten wurden im Vergleich zum Wildtyp bezüglich ihrer proteolytischen Aktivität vor und nach Inkubation mit Serpin B9 untersucht, bezüglich ihrer Bindungsaffinität zu den Zielzellen, ihrer Serumstabilität sowie der zytotoxischen und apoptotischen Aktivität. Eine aus acht neu generierten Mutanten war am effektivsten um Serpin B9-positive Zellen in vitro abzutöten. Diese Mutante wurde folglich innerhalb von in vivo Experimenten weiter untersucht. Als Tiermodell für Hodgkin Lymphom war bisher nur das Modell basierend auf Serpin B9-negative L540cy Zellen etabliert. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein weiteres Tiermodell basierend auf der Zelllinie L428 und in vivo „Imaging“ Methoden etabliert. Mit Hilfe dieses Modells konnte nachgewiesen werden, dass die neue Granzym B Variante in der Tat sowohl Serpin B9-positive als auch Serpin B9-negative Zellen in vivo abtöten kann. Das Gleiche konnte im Anschluss ex vivo unter Anwendung von primären CMML und AMML Zellen, die ebenfalls teilweise Serpin B9 exprimiert haben, (Kooperation mit Uniklinikum Aachen) gezeigt werden. Zusätzlich konnte innerhalb dieser Studien CD64 als neuer Tumormarker für diese seltenen Erkrankungen identifiziert werden, sowie seine Ko-expression mit den bekannten Markern CD33, CD14 und CD56. Außerdem wurde die Effektivität des bekannten auf dem bakteriellen Pseudomonas Exotoxin A basierenden Immuntoxins von der neuen Variante übertroffen, was eine Rolle bei der individualisierten Medizin spielen kann. Ein weiterer Ansatz war es ein neues humanes Granzym-basierendes zytolytisches Fusionsprotein zu evaluieren um Serpin B9-positive Zellen abzutöten. Die pro-apoptotische Komponente war in diesem Fall Granzym M. Während in vitro und ex vivo Studien konnte die zytotoxische Aktivität dieses neuen Konstrukts ebenfalls erfolgreich nachgewiesen werden. Insgesamt wurden innerhalb dieser Arbeit zwei neue Effektormoleküle, Granzym M sowie eine neue Variante von Granzym B (R201K), generiert, produziert und ihr zytotoxisches Potential für die Immuntherapie von Leukämie und Hodgkin Lymphom sowohl in vitro, also auch ex vivo und zum Teil in vivo nachgewiesen werden. Diese Effektormoleküle können zukünftig, entweder in Kombination oder einzeln, klinisch relevant werden um sowohl solide Tumore als auch andere hämatologische Erkrankungen zu behandeln, bei denen Serpin B9 bei der Umgehung der natürlichen Immunantwort eine Rolle spielt.

Current cancer treatments often lack specificity and therefore also kill healthy cells, resulting in severe side effects. To improve the specificity of cancer treatment recombinant chimeric proteins such as immunotoxins have been developed consisting of a tumor-selective binding domain (antibody or derivative thereof) and a pro-apoptotic protein (classically plant- or bacteria-derived). To avoid immunogenic responses recent studies have focused on the development of fully human cytolytic fusion proteins (CFPs), containing cytotoxic components of human origin. Most promising are enzymes involved in the immune response, such as the granule-associated proteases (granzymes). The best studied is granzyme B. However, its anti-tumoral efficacy is limited by irreversible inhibition by serpin B9 (PI 9) which is co-expressed in the cytosol of cytotoxic immune cells to avoid auto-toxicity in case of misdirected granzyme B. Several tumors have also been described to express PI 9, such as breast cancer, prostate cancer, acute leukemia and Hodgkin lymphoma (HL). As a very high number of positive tumor cells predicts unfavorable clinical outcome, these might be positively selected because they evade the immune surveillance. Killing these treatment-resistant cells may therefore strongly increase therapeutic success and possibly life span. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate novel cytolytic fusion proteins which are able to induce cell death independent of PI-9. One approach was to generate PI 9-resistant granzyme B variants. To elucidate the interacting amino acids between granzyme B and PI 9, in silico simulations (cooperation with the German Research School in Juelich, Prof. Carloni) were applied to find promising mutational sites. Corresponding point-mutations were inserted into the wild-type granzyme B sequence which was fused to the CD64-(high-affinity receptor for IgG:Fc gammaRI, over-expressed e. g. on AML cells) or CD30- (cell membrane protein of the tumor necrosis factor receptor family, over-expressed e. g. on HL cells) binding single chains H22 or Ki4, respectively. The new mutants were evaluated in comparison to the wild-type structures in respect to proteolytic activity in absence and presence of recombinant PI-9, binding affinity, cytotoxic and apoptotic activity and serum stability. One mutant out of eight was able to induce apoptosis in PI-9-positive cells so that this variant was further tested in vivo. As animal model for HL, only PI 9-negative L540cy cells are established yet. Here, a novel tumor model with the PI 9-expressing HL cell line L428 was established based on optical in vivo imaging. Subsequently, in this proof-of-principle model, it could be verified in vivo that only the mutant was able to kill cells both in presence and absence of the inhibitor in contrast to the wild-type. This is analogous to ex vivo studies (cooperation with the university clinicum Aachen) using CMML and AMML primary cells. Additionally, CD64 was hereby identified to be a valuable tumor marker for these rare diseases and is mostly co-expressed with the known markers CD33, CD14 and CD56. The data also demonstrated that the new construct performed even better than the immunotoxin based on the bacterial Pseudomonas exotoxin A which can be important for individualized medicine. Another approach was to evaluate a novel human granzyme-based CFP with a pro-apoptotic moiety based on granzyme M. During in vitro and ex vivo studies it was demonstrated that granzyme M is a potent human anti-tumor cytotoxic agent, which is able to kill target cells even in presence of PI 9. In summary, during this thesis two new effector molecules, granzyme M and a variant of granzyme B, granzyme B R201K, have successfully been generated, produced and evaluated in vitro, ex vivo and in parts also in vivo in regard to their cytotoxic potential and for use in immunotherapy to treat leukemic diseases or HL. These effector molecules, either individually or in combination, also bear clinical relevance for the treatment of solid tumors or other hematological disorders that potentially express PI-9 or selected PI-9-positive cells under immune surveillance or tumor therapy.

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