Synthesis of neo-glycoproteins for binding studies and scavenging of Clostridium difficile toxin A - of microgels and biosensors

Heine, Viktoria; Schwaneberg, Ulrich; Elling, Lothar

doi:10.18154/RWTH-2021-06608

Synthesis of neo-glycoproteins for binding studies and scavenging of Clostridium difficile toxin A - of microgels and biosensors = Synthese von Neo-Glykoproteinen für Bindungsstudien und das Abfangen von Clostridium difficile Toxin A – von Mikrogelen und Biosensoren

Heine, Viktoria^RWTH*

2021

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Viktoria Heine, Master of Science (M.Sc.) Biotechnologie

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2021

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH* ; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2021-07-01

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2021-06608
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/822226/files/822226.pdf

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Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Clostridium difficile TcdA (frei) ; biosensors (frei) ; fucosyltransferases (frei) ; microgels (frei) ; neo-glycoproteins (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Infektionen durch Clostridium difficile verursachen enorme Kosten im Gesundheitswesen. Das Bakterium besiedelt den menschlichen Darmtrakt und sondert Toxine ab, die die Epithelzellschicht des Dickdarms zerstören. Die Toxine binden an Zelloberflächenglykane auf menschlichen Darmzellen und lösen Prozesse aus, die schließlich zum Zelltod führen. Da Toxin A eine Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne mit kombinierten repetitiven Oligopeptid-Domänen umfasst, kann es mehrere Glykan-Liganden auf einmal binden. Diese Eigenschaft kann zur Erhöhung der Wechselwirkungsstärke zwischen Ligand und Toxin durch Multivalenz ausgenutzt werden und lässt sich auf andere Toxine mit Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen übertragen. Um den bestmöglichen Liganden für C. difficile Toxin A zu finden, wurde eine Ligandenbibliothek (in Microtiterplatten) erstellt. Multivalente Neo-Glykoproteine dienten als Gerüst für komplexe Glykosylierungsmuster, um eine Bibliothek von 40 Glykanstrukturen zusammenzustellen. Das Screening dieser Bibliothek mit der Rezeptordomäne von Toxin A präsentierte Lewisy-Lewisx-BSA als vielversprechenden Toxin-Scavenger. Tests mit dem Holotoxin bestätigten die Ergebnisse und der Ligand wurde für in vitro Anwendungen hergestellt. Für die Synthese des Glykans (Lewisy-Lewisx) wurde ein Satz effizienter Fucosyltransferasen etabliert und mit einer Reihe neuer Substrate (N-Acetyllactosamin-Tetrasaccharide) getestet, wobei unerwartete Fucosylierungsmuster entdeckt wurden. Der Toxin-A-Ligand wurde hergestellt und an BSA gekoppelt. Die so produzierten Neo-Glycoproteine wurden für die Kopplung an Mikrogele weiterverwendet. Neo-Glykoproteine und Neo-Glykoprotein-präsentierende Mikrogele waren in der Lage, menschliche Zellen vor Toxin A zu schützen. Außerdem zeigten die Neo-Glykoproteine eine gute Affinität zum Cholera-Toxin. Daher kann Lewisy-Lewisx-BSA als ein Zwei-in-Eins-Ligand angesehen werden. Um ein tieferes Verständnis des Bindungsverhaltens zu ermöglichen, wurde ein Neo-Glykoprotein-Biosensor etabliert. BSA-Neo-Glykoproteine, die N-Acetyllactosamin tragen, wurden an den Biosensor gebunden und auf dem Chip glykosyliert. Online-Messungen ermöglichten erstmals die Echtzeit-Untersuchung der kinetischen Bindungsprozesse zwischen Glykan und Enzym bzw. Glykan und Lektin mittels elektrochemischer Impedanzspektroskopie. Dieser Ansatz könnte auf eine Vielzahl von Interaktionspartnern übertragen werden. Zusammenfassend ebnet diese Arbeit den Weg zur Behandlung bakteriell assoziierter Erkrankungen durch die Etablierung von Toxin-Scavengern und die Entwicklung neuartiger Analysemethoden für Toxin-Ligand-Wechselwirkungen.

Clostridium difficile infections cause enormous costs in the health care sector. The bacterium colonizes the human intestinal tract and secretes toxins that destroy the epithelial cell layer of the colon. The toxins bind to cell-surface glycans on human intestinal cells and induce processes that eventually lead to cell death. Since toxin A comprises a carbohydrate recognition domain with combined repetitive oligopeptide domains, it can bind multiple glycan ligands at once. This feature can be exploited for increasing the interaction strength between ligand and toxin by multivalency and can be transferred to other toxins comprising carbohydrate recognition domains. To find the best possible toxin ligand for C. difficile toxin A, we established an in-plate ligand library. Multivalent neo-glycoproteins served as scaffold for complex glycosylation patterns to assemble a variety of 40 glycan structures. Screening of this library with the receptor domain of toxin A presented Lewisy-Lewisx-decorated BSA as promising toxin scavenger. Tests with the holotoxin confirmed the findings and the ligand was produced for in vitro applications. For the production of the glycan (Lewisy-Lewisx), a set of efficient fucosyltransferases was established and tested with a range of new substrates (N-acetyllactosamine tetrasaccharides), revealing unexpected fucosylation patterns. The toxin A scavenger was produced and coupled to BSA. They were further utilized for coupling to microgels. Neo-glycoproteins and neo-glycoprotein-presenting microgels were able to protect human cells from toxin A. Furthermore, the neo-glycoproteins showed a good affinity to the Cholera toxin. Hence, Lewisy-Lewisx-BSA is considered a one-for-two scavenger. To enable a deeper understanding of the binding behavior, a neo-glycoprotein biosensor was established. BSA-neo-glycoproteins carrying N-acetyllactosamine were bound to the biosensor and glycosylated on-chip. Online measurements enabled the real-time investigation of kinetic binding processes between glycan and enzyme or glycan and lectin via electrochemical impedance spectroscopy for the first time. This approach could be transferred to a variety of interaction partners. Summarizing, this work paves the way towards the treatment of bacterial-associated diseases by establishing toxin scavengers and developing novel analytical methods for toxin-ligand interactions.

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