Einfluss des Epstein-Barr-Virus kodierten Membranproteinkomplex BDLF2/BMRF2 auf Signaltransduktionsmechanismen der Wirtszelle

Mühe, Janine; Ritter, Klaus

doi:999910133437

Einfluss des Epstein-Barr-Virus kodierten Membranproteinkomplex BDLF2/BMRF2 auf Signaltransduktionsmechanismen der Wirtszelle = Influence of the Epstein-Barr virus encoded protein complex BDLF2/BMRF2 on signal transduction mechanisms of the host cell

Mühe, Janine

2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Janine Mühe

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

UmfangIV, 168 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Ritter, Klaus (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-01-10

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-39681
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/82699/files/3968.pdf

Einrichtungen

Lehr- und Forschungsgebiet Virologie (525500-3)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Epstein-Barr-Virus (Genormte SW) ; Zellskelett (Genormte SW) ; Signaltransduktion (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; BDLF2 (frei) ; BMRF2 (frei) ; Epstein-Barr virus (frei) ; cytoskeleton (frei) ; signal transduction (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Die Epstein-Barr Virus kodierten Glykoproteine BDLF2 und BMRF2 sind Strukturproteine und Bestandteil der viralen Hülle. Die Proteine bilden an der Plasmamembran einen Komplex, der die Morphologie der Wirtszelle durch Induktion langer, verzweigter zytoplasmatischer Ausläufer moduliert. In dieser Arbeit wurden erstmals Regulations-mechanismen für BDLF2 und BMRF2 untersucht sowie die Wirkungsweise des Komplexes, insbesondere in Bezug auf die Zellmorphologie, aufgeklärt. Die Untersuchungen zur Regulation der BDLF2-Expression führten zum Nachweis einer negativen Regulation des BDLF2-Promotors durch die viralen Transaktivatoren Zta und Rta und zur Identifizierung einer Zta-/Rta-regulierten Region im Bereich 20-40 bp vor dem ATG. Die Analysen der Komplexbildung und posttranslationaler Modifikationen zeigten (1) eine Abhängigkeit des BDLF2-Transports zur Plasmamembran von der BMRF2-Expression und die geringe Abhängigkeit des BMRF2-Transports von BDLF2, (2) N-verknüpfte Glykosylierungen als posstranslationale Modifikation von BDLF2, die unabhängig von der BMRF2-Expression sind sowie (3) Phosphorylierungen von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten des BMRF2-Proteins unabhängig von der BDLF2-Expression. Eine Phosphorylierung von BDLF2 wurde nicht nachgewiesen; die Glykosylierung von BMRF2 entsprach dem literaturbekannten Muster. Die Untersuchung funktionaler Domänen von BDLF2 führte zur Identifizierung (1) der Aminosäuren 1-130 am N-Terminus als Induktor des Phänotyps, (2) des C-Terminus als Bindungspartner von BMRF2, (3) der Bindung des funktional nicht charakterisierten, zellulären Proteins Fam35A an die Aminosäuren 110-130 des BDLF2-Proteins und (4) eines ER-Retentionssignals innerhalb der Transmembrandomäne (AS 182-208). Untersuchungen zur Modulation zellulärer Signalwege ergaben (1) die Repression der Aktivität von Ezrin/Radixin/Moesin (ERM), aber keines anderen untersuchten Proteins des RhoA-Signalwegs (RhoA, ROCK, mDIA, Cofilin, FAK, VASP, PKCalpha, PI4P5K) durch BDLF2/BMRF2-Expression, (2) die Ausbildung eines dem BDLF2/BMRF2-Effekt vergleichbaren Phänotyps nach Inhibition der ERM-Proteine, (3) die Interaktion des BDLF2/BMRF2-Komplexes mit PKCalpha und (4) die Reduktion der PKCα-Bindung an ERM-Proteine unter BDLF2/BMRF2-Expression. Versuche zur Herstellung von EBV-Mutanten lieferten eine dBDLF2-EBV-Mutante und eine Cherry-BFP-Mutante, die die Fusionsproteine mCherry-BDLF2 und BFP-BMRF2 exprimiert. Keine Mutante zeigt Unterschiede zum Wildytp in Virusfreisetzung und Expression viraler Gene nach Infektion von primären B-Lymphozyten und Monozyten. Infektionen mit der dBDLF2-EBV-Mutante zeigten im Vergleich zu Wildtyp-EBV-Infektionen eine Reduktion von Zellausläufern. Diese Arbeit zeigt, dass die Expression bzw. Aktivität des BDLF2/BMRF2-Komplexes durch Zta, Rta, Glykosylierung und Phosphorylierung beeinflusst werden. Bindungs- und Aktivitätsdomänen des Komplexes wurden ebenso identifiziert wie auch BDLF2-bindende Proteine. Die Signalisierung des auch bei primären Zellen und unter Verwendung von EBV-Mutanten nachvollziehbaren, BDLF2/BMRF2-vermittelten Effekts wird unter Beteiligung von PKCalpha-Retention in einem indirekten Mechnismus über ERM-Proteine vermittelt. Die in dieser Arbeit erzeugten EBV-Mutanten ermöglichen erstmals eine Analyse der identifizierten Regulations- und Funktionsmechnismen von BDLF2 und BMRF2 im Verlauf einer Infektion.

The Epstein-Barr virus encoded glycoproteins BDLF2 und BMRF2 are structural proteins and part of the viral envelope. The proteins form a complex at the plasma membrane, which modulates the morphology of the host cell by inducing long, branched cytoplasmatic protrusions. This work investigated for the first time mechanisms that regulate BDLF2 and BMRF2 as well as the mode of action of the protein complex, particularly with regard to the cellular morphology.Examinations of the regulation of the BDLF2 expression showed negative regulation of the BDLF2 promoter through the viral transactivators Zta and Rta, and identified a Zta-/Rta-regulated region 20-40 bp upstream the ATG. Analyses of complex formation and posttranslational modifications showed (1) that transport of BDLF2 to the plasma membrane is dependent on BMRF2 expression, while BMRF2-transport is hardly dependent on BDLF2, (2) N-linked glycosylation as posttranslational modifications of BDLF2, which are BMRF2-independent, and (3) phosphorylation of serine-, threonine- and tyrosine-residues of BMRF2 independent of BDLF2 expression. BDLF2 is not phosphorylated; glycosylation of BMRF2 was detected as described in the literature. Investigations of functional domains of BDLF2 lead to the identification of (1) N-terminal amino acids 1-130 as inductor of the phenotype, (2) the C-terminus as BMRF2 binding domain, (3) interaction of BDLF2 amino acids 110-130 with the yet uncharacterized, cellular protein Fam35A, and (4) an ER retention signal inside the transmembrane domain (aa 182-208). Examinations regarding the modulation of cellular signaling pathways revealed (1) repression of Ezrin/Radixin/Moesin (ERM) activity due to BDLF2/BMRF2-expression, but not of the other analyzed proteins of the RhoA signaling cascade (RhoA, ROCK, mDIA, Cofilin, FAK, VASP, PKCalpha, PI4P5K), (2) that inhibition of ERM-proteins leads to a phenotype comparable to the BDLF2/BMRF2-triggered one, (3) an interaction of BDLF2/BMRF2 with PKCalpha, and (4) reduced interaction of PKCalpha and ERM-proteins in BDLF2/BMRF2-expressing cells. In this work EBV-mutants were constructed that are either BDLF2-deficient or express BDLF2 and BMRF2 fused to mCherry and BFP, respectively. Compared to wildtype EBV, none of the mutants showed differences regarding virus release or expression of viral genes after infection of primary B-lymphocytes and monocytes. Cells infected with BDLF2-deficient EBV showed a reduction of cellular protrusions compared to wildtype infected cells. This thesis shows that expression and activity of the BDLF2/BMRF2-complex are regulated by Zta, Rta, glycosylation, and phosphorylation. Active and interacting domains of the complex were identified as well as BDLF2-binding proteins. The BDLF2/BMRF2-triggered effect, which was reproduced in primary cells and with the help of EBV-mutants, is mediated by PKCalpha retention and indirectly through ERM-proteins. The herein described EBV-mutants make it possible to analyze mechanisms of BDLF2/BMRF2 regulation and function during viral infection.

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