Microgels as protein and enzyme carriers: a pathway to biocatalytic glycan synthesis

Sommerfeld, Isabel Katja; Pich, Andrij; Elling, Lothar

doi:43579

Microgels as protein and enzyme carriers: a pathway to biocatalytic glycan synthesis = Mikrogele als Träger für Proteine und Enzyme: ein Weg zur biokatalytischen Glykansynthese

Sommerfeld, Isabel Katja^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Isabel Katja Sommerfeld, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Pich, Andrij (Thesis advisor)^RWTH* ; Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-08-28

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-08211
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/992494/files/992494.pdf

Einrichtungen

Projekte

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Enzymimmobilisierung (frei) ; Glykansynthese (frei) ; Glykosyltransferasen (frei) ; Mikrogele (frei) ; Multi-Responsivität (frei) ; Polyelektrolyte (frei) ; Polymere (frei) ; Stimuli-Responsivität (frei) ; automated enzymatic glycan synthesis (AEGS) (frei) ; automatisierte enzymatische Glykansynthese (AEGS) (frei) ; enzyme immobilization (frei) ; glycan synthesis (frei) ; glycosyltransferases (frei) ; microgels (frei) ; multiresponsiveness (frei) ; polyelectrolytes (frei) ; polymers (frei) ; stimuli-responsiveness (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die Kombination aus funktionalisierten Mikrogelen und Biomakromolekülen eröffnet vielseitige Anwendungen in der Biomedizin und Biotechnologie, insbesondere bei enzymatischen Synthesen. Diese Arbeit befasst sich mit der Synthese verschiedener Mikrogele zur Aufnahme von Proteinen und Enzymen. Zunächst wurden stimuli-responsive, ionisierbare Mikrogele mittels Fällungspolymerisation synthetisiert. Diese Mikrogele wurden mit verschiedenen Techniken wie Infrarotspektroskopie, dynamischer und elektrophoretischer Lichtstreuung, NMR-Relaxometrie und Elektronenmikroskopie charakterisiert, wobei besonders die Stimuli-Responsivität untersucht wurde. Besonders wichtig ist, dass diese biokompatiblen Mikrogele ihre Eignung zur ionischen Bindung des positiv geladenen Cytochrom c zeigten und somit ihr Potenzial für die Proteinimmobilisierung unter Beweis stellten. Anschließend wurde die Immobilisierung einer His6-Tag Hyaluronan-Synthase in diesen Mikrogelen über Metallchelat-Affinität untersucht, wobei die Verwendung von Ni2+ die besten Ergebnisse lieferte. Hyaluronsäure wurde wiederholt in hervorragenden Ausbeuten produziert, was mittels Kapillarelektrophorese überwacht wurde. Zusätzlich wurden weitere Glycosyltransferasen in Polyethylenglykol-basierten Mikrogelen immobilisiert, die mittels tropfenbasierter Mikrofluidik synthetisiert wurden. Die Enzymimmobilisierung durch On-Chip-Einkapselung wurde mit der Anbindung von Enzymen an zuvor synthetisierte Mikrogele verglichen. Für die Enzymanbindung wurden Thiol-Michael-Addition, selektive SpyTag-SpyCatcher-Interaktion und nicht-kovalente Wechselwirkungen genutzt. Die Analyse der Mikrogele umfasste optische Mikroskopie, Infrarotspektroskopie und Permeabilitätstests. Darüber hinaus wurde die Enzymimmobilisierung mittels Bradford- und Fluorescamin-Tests bestätigt, während die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zur Überprüfung der enzymatischen Aktivitäten genutzt wurde. Mit den am besten geeigneten Glycosyltransferase-Mikrogelen wurden Kaskadenreaktionen durchgeführt, um eine größere Bibliothek von Glykanprodukten zu erzeugen und Wege zu einer effizienteren Glykansynthese aufzuzeigen. Die verschiedenen Erkenntnisse unterstreichen das synergetische Potenzial der Kombination von Mikrogelen mit Biomakromolekülen in biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen und ebnen den Weg für Fortschritte in diesen Bereichen, insbesondere bei der enzymatischen Synthese komplexer Glykane.

The combination of functionalized microgels with biomacromolecules presents versatile opportunities in biomedical and biotechnological fields, offering enhanced biocatalytic applications. This thesis therefore focuses on the synthesis of different microgels for the loading of proteins and enzymes. First, stimuli-responsive microgels containing ionizable functional groups were synthesized utilizing precipitation polymerization. These microgels were characterized using various techniques such as Infrared Spectroscopy, Dynamic and Electrophoretic Light Scattering, NMR relaxometry, and Electron Microscopy. The responsiveness of the microgels to various stimuli was elucidated. Most importantly, these biocompatible microgels demonstrated their utility for ionic binding of positively charged cytochrome c, thereby showcasing their potential for protein immobilization. Moreover, immobilizing His6-tagged hyaluronan synthase onto these microgels via metal affinity binding, particularly using nickel ions, enabled repetitive enzymatic production of hyaluronic acid with unmatched yields, as monitored through capillary electrophoresis. Additionally, other glycosyltransferases were immobilized onto poly(ethylene glycol)-based microgels synthesized using droplet-based microfluidics. Enzyme immobilization through on-chip encapsulation was compared to post-attachment of enzymes to pre-synthesized microgels. For enzyme attachment, non-selective thiol Michael addition and selective SpyTag-SpyCatcher interaction were utilized, complemented by immobilization through mainly non-covalent interactions. Analysis of microgels involved optical microscopy for size determination, infrared spectroscopy for determination of chemical composition, and permeability assays for porosity assessment. Additionally, enzyme immobilization was confirmed using Bradford and fluorescamine assays while High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed the enzymatic activities for each glycosyltransferase. Utilizing the most suitable glycosyltransferase-microgels, cascade reactions were demonstrated, showcasing potential pathways toward a larger library of glycan products and a more efficient glycan synthesis. These findings underscore the synergistic potential of combining microgels with biomacromolecules in biomedical and biotechnological applications, particularly in the enzymatic production of complex glycans.

OpenAccess:
PDF
(zusätzliche Dateien)