Unravelling extracellular matrix impact on retinal pigment epithelium mechanical homeostasis and functionality: a multidimensional approach with stem cell-derived models

Kozyrina, Aleksandra; Leube, Rudolf; Di Russo, Jacopo; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion

doi:43800

Unravelling extracellular matrix impact on retinal pigment epithelium mechanical homeostasis and functionality: a multidimensional approach with stem cell-derived models

Kozyrina, Aleksandra^RWTH*

2024

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Aleksandra Kozyrina, M.Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2024

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2024

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Di Russo, Jacopo (Thesis advisor)^RWTH* ; Leube, Rudolf (Thesis advisor)^RWTH* ; Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2024-11-19

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2024-10960
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/996968/files/996968.pdf

Einrichtungen

Projekte

GRK 2415 - GRK 2415: Mechanobiology in Epithelial 3D Tissue Constructs (363055819) (363055819)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Epithelzellen sind miteinander verbunden und erlangen dadurch mesoskalige mechanische Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen, spezifische Gewebefunktionen zu erfüllen. Im homöostatischen Zustand beruhen diese mechanischen Eigenschaften auf einem Gleichgewicht zwischen interzellulärer Spannung und der Adhäsion an die darunterliegende extrazelluläre Matrix (ECM). Dieses Gleichgewicht ist entscheidend für die Gewebefunktion, insbesondere im postmitotischen Epithel wie dem retinalen Pigmentepithel (RPE), das aufgrund des Fehlens von Zellteilungen ständig Remodeling-Prozesse durchlaufen muss, um den natürlichen Zellverlust auszugleichen. Die ECM, die aus einer Vielzahl von Proteinen besteht, spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung dieses Kraftgleichgewichts und beeinflusst die Zellmechanik und das Zellverhalten. Wie jedoch Veränderungen in der ECM-Zusammensetzung die Fähigkeit des RPE beeinflussen, seine essenziellen Funktionen aufrechtzuerhalten, ist bislang nur unzureichend verstanden. Das RPE ist eine wesentliche Komponente der Retina und verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Photorezeptoren sowie die Unterstützung des Sehvermögens. Täglich phagozytieren und recyceln RPE-Zellen Fragmente von Photorezeptorzellen, sogenannte äußere Segmente der Photorezeptoren (POS), um deren ordnungsgemäße Erneuerung und die Gesundheit des Gewebes zu gewährleisten. In dieser Forschung habe ich die Hypothese aufgestellt, dass die biochemischen und physikalischen Eigenschaften der ECM, insbesondere die Variationen in Laminin-Isoformen, welche wichtige biochemische Regulatoren innerhalb der ECM darstellen, die Zellmechanik und Funktionalität des RPE direkt beeinflussen. Zur Untersuchung dieser Hypothese habe ich mehrere reduktionistische Modelle entwickelt, die auf menschlichen, aus Stammzellen abgeleiteten RPE-Zellen basieren. Ein Modell umfasste retinale Sphäroide in Suspensionskultur, die eine biochemische Stimulation der Zellen mit spezifischen ECM-Komponenten ohne mechanische Interferenzen aus der Umgebung ermöglichten. Ein weiteres Modell beinhaltete RPE-Zellen, die auf weichen Hydrogelen kultiviert wurden, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an Lamininen beschichtet waren. Diese Anordnung simulierte die natürliche ECM-Umgebung der Retina und erlaubte die Kontrolle über ECM-Signale. Die mechanischen Eigenschaften der RPE-Zellen wurden mit Hilfe von Traction-Force-Mikroskopie, Monolayer-Stress-Mikroskopie und Nanoindentation quantifiziert. Darüber hinaus untersuchte ich, wie die zelluläre Kontraktilität – ein Indikator für mechanischen Stress – ihre Fähigkeit beeinflusst, POS zu phagozytieren, eine essenzielle Funktion für die Gesundheit der Retina und des Sehvermögens. Die Forschung zeigte, dass die Funktionalität der RPE-Zellen signifikant durch die Dichte und Zusammensetzung von Laminin beeinflusst wird. Insbesondere führten niedrigere Konzentrationen von Laminin 511 zu erhöhter Zellbelastung und verringerter phagozytischer Fähigkeit, während das Gegenteil bei Laminin 332 der Fall war. Ich konnte nachweisen, dass das Verhältnis spezifischer Integrin-Rezeptoren (β1 und β4) diese Interaktionen moduliert, wodurch das Gleichgewicht zwischen Aktin- und Keratin-Zytoskelettnetzwerken verändert wurde, was wiederum die mechanische Stabilität des Gewebes bestimmte. In-vivo-Daten bestätigten diese Ergebnisse und zeigten, dass die Laminindichte zur retinalen Peripherie hin abnimmt, was mit einer reduzierten funktionellen Anforderung übereinstimmt und auf ein ECM-definiertes mechanisches Gefälle innerhalb des RPE hinweist. Zusammenfassend unterstreicht meine Arbeit die Bedeutung der ECM-Vielfalt für die Aufrechterhaltung der mechanischen Homöostase und Funktionalität von RPE-Zellen. Die vorgestellten Ergebnisse heben die entscheidende Rolle der Mechanik für die visuelle Funktion hervor und liefern wertvolle Einblicke in die Gesundheit und Erkrankungen der Retina. Diese Forschung bietet eine neue Perspektive darauf, wie ECM-Variationen, insbesondere altersbedingtes Remodeling, die Zelladhäsion und das mechanische Gleichgewicht stören können, was möglicherweise zu Netzhauterkrankungen wie der altersbedingten Makuladegeneration führt. Weitere Studien sind erforderlich, um das volle Ausmaß dieser ECM-induzierten Veränderungen im mechanischen Status des RPE zu verstehen und mögliche Behandlungsansätze zu erforschen.

Epithelial cells are interconnected, whereby they acquire mesoscale mechanical properties to accomplish specific tissue functions. In a homeostatic state, these mechanical properties rely on a balance between intercellular tension and adhesion to the underlying extracellular matrix (ECM). This balance is crucial for tissue function, particularly in postmitotic epithelium like retinal pigment epithelium (RPE), which due to lack of cell division, must undergo constant remodelling events to compensate for natural cell loss. The ECM, composed of a multitude of proteins, plays a pivotal role in regulating this force balance, influencing cell mechanics and behaviour. However, how changes in the ECM composition influence the ability of RPE to maintain their essential functions remains poorly understood. Overall, RPE is a vital component of the retina, responsible for maintaining photoreceptor homeostasis and supporting vision. Daily, RPE cells phagocyte and recycle fragments of photoreceptor cells called photoreceptor outer segments (POS), to ensure their proper renewal and overall health of the tissue. In this research, I hypothesized that the biochemical and physical properties of the ECM, particularly the variations in laminin isoforms, which are key biochemical regulators within the ECM, directly influence RPE cell mechanics and functionality.To study this, I developed several reductionist models using human stem cell-derived RPE cells. One model involved retinal spheroids in suspension culture, which allowed for the biochemical stimulation of cells with specific ECM components without mechanical interference from the environment. Another model included RPE cells cultured on soft hydrogels coated with different concentrations of laminins. This setup simulated the natural ECM environment of the retina and allowed control over the ECM cues. The mechanical properties of RPE cells were quantified using traction force microscopy, monolayer stress microscopy, and nanoindentation. Further, I explored how cellular contractility—an indicator of mechanical stress—affects their ability to phagocyte POS, a function essential for retinal health and vision.The research revealed that the functionality of RPE cell is significantly influenced by laminin density and composition. Particularly, lower laminin 511 concentrations led to increased cellular strain and reduced phagocytic ability, which was conversely the case with laminin 332. I demonstrated that the ratio between specific integrin receptors (β1 and β4) modulated these interactions, altering the balance between actin and keratin cytoskeletal networks, which in turn determined the overall mechanical stability of the tissue. In vivo data supported these findings, showing that laminin density decreases towards the retinal periphery, aligning with reduced functional demand and indicating the presence of ECM-defined mechanical gradient within the RPE.In conclusion, my work highlights the importance of ECM diversity in maintaining the mechanical homeostasis and functionality of RPE cells. The findings presented in this work highlight the crucial role of mechanics in visual function and offer valuable insights into retinal health and disease. This research provides a novel perspective on how ECM variations, particularly age-related remodelling, may disrupt cellular adhesion and mechanical balance, potentially leading to retinal disorders such as age-related macular degeneration. Further studies are needed to fully understand the extent to which these ECM-induced changes in RPE mechanical status contribute to retinal diseases and to explore potential treatments.

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