Automation, miniaturization, and parallelization of isotopic labeling experiments for the advanced analysis of microbial systems

Nießer, Jochen; Wiechert, Wolfgang; Blank, Lars M.

doi:44124

Automation, miniaturization, and parallelization of isotopic labeling experiments for the advanced analysis of microbial systems

Nießer, Jochen^RWTH*

2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von M. Sc. Jochen Nießer

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2025

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2025

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH* ; Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-01-30

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-01685
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1004881/files/1004881.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Generierung und Optimierung von Bioprozessen und Stämmen zum Zwecke der industriellen Anwendung wie auch der Erforschung fundamentaler biologischer Hypothesen erfordert adäquate Phänotypisierungsexperimente. Oftmals entsteht dabei ein Spannungsfeld zwischen Informationsgehalt und experimentellem Durchsatz, welches durch die Beschleunigung der Erzeugung genetischer Diversität und Kultivierung von genetisch veränderten Stämmen nur an Relevanz gewonnen hat. Isotopenmarkierungsexperimente befinden sich am extrem hoher Informativität und geringen Durchsatzes mit der zusätzlichen Einschränkung, dass pro Experiment erhebliche Kosten anfallen. Üblicherweise werde diese in Bioreaktoren im Labormaßstab, Schüttelkolben und – als Resultat jüngster Fortschritte – in Minibioreaktoren durchgeführt, was folglich einer Skala von Litern bis zu Millilitern entspricht. In der vorliegenden Dissertation wird ein automatisierter, miniaturisierter und parallelisierter Versuchsaufbau etabliert und validiert, der die Vorteile moderner Pipettierroboter und Mikrobioreaktoren kombiniert. Die Entwicklung einer automatisierten Quenching-Methode ermöglicht die Analyse von Isotopenmarkierungsmustern freier Aminosäuren sowie von Intermediaten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels im Mikrolitermaßstab. Diese Methode wird alsdann in eine Pipeline für Isotopenmarkierungsexperimente eingebettet, die auf biologische Fallstudien angewandt wird. Zum Zwecke der Realisierung einer solchen Pipeline werden mehrere Python-Programme entwickelt. Besonders hervorzuheben ist darunter das Open-Source-Paket PeakPerformance, das einen innovativen Peak-Fitting-Ansatz mittels Bayes'scher Inferenz verwendet, um chromatographische Peakdaten auszuwerten. In einer ersten Fallstudie wird ein neuartiger Ansatz zur Modellierung von Bioprozessen für die Abschätzung intrazellulärer Metabolitkonzentrationen entwickelt und an dem Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum demonstriert. Dabei werden die Poolgrößen mehrerer Aminosäuren, deren Synthesewege von der Glykolyse abzweigen, mit relativ hoher Sicherheit identifiziert. Als zweite Fallstudie wird erstmals eine isotopisch nichtstationäre 13C-metabolische Flussanalyse im Mikrolitermaßstab durchgeführt, um das Fluxom des evolvierten Stammes C. glutamicum WT_EtOH-Evo zu ermitteln, welches auf Ethanol als Kohlenstoffquelle kultiviert wurde. Da zuvor noch kein solches Fluxom von C. Glutamicum mit Wachstum auf Ethanol veröffentlicht wurde, können hier neue Erkenntnisse über die Nutzung metabolischer Stoffwechselwege gewonnen werden, insbesondere eine erhöhte Aktivität des Glyoxylatzyklus im Vergleich zu anderen Substraten, die gleichermaßen über Acetyl-CoA in den zentralen Kohlenhydratstoffwechsel gelangen.

The generation and optimization of bioprocesses and strains for industrial application as well as the investigation of fundamental biological research hypotheses require adequate phenotyping experiments. Generally, there is a trade-off between informativeness and experimental throughput which became ever more relevant as the creation of genetic diversity and cultivation of mutant strain variants was increasingly accelerated. Isotopic labeling experiments are located at the extreme of high informativeness and low throughput with the additional limitation of significant associated costs per experiment. Commonly, they are conducted in lab-scale bioreactors, shakingflasks, and as the result of recent advances in mini-bioreactors at a scale ranging from liters to milliliters. In the present dissertation, an automated, miniaturized, and parallelized experimental setup taking advantage of modern liquid handling robots and microbioreactors is established and validated. The development of an automated quenching method for this workflow enables the analysis of labeling patterns from free amino acids and intermediates of the central carbon metabolism, even at a microliter scale. It is then embedded into an overarching integrated pipeline for isotopic labeling experiments and applied to biological case studies. In order to realize such a pipeline, multiple Python programs are constructed and most notably the open source package PeakPerformance using an innovative peak fitting approach by Bayesian inference is developed and utilized for the evaluation of chromatographic peak data. For the first application study, a novel bioprocess modelling approach for estimating intracellular metabolite pool sizes based on 13C-labeling data is developed and demonstrated in Corynebacterium glutamicum. Thereby, the pool sizes of multiple amino acids the synthesis pathways of which are branching from the glycolysis were identified with a relatively high certainty. For the second study, the first ever automated isotopically non-stationary 13C-metabolic flux analysis is conducted at an unprecedented microliter scale to elucidate the fluxome of the evolved strain C. glutamicum WT_EtOH-Evo grown on ethanol as the sole carbon source. Since no fluxome of C. glutamicum grown exclusively on ethanol had been published prior, new insight regarding the pertaining pathway usage was generated, in particular an increased glyoxylate shunt activity compared to other substrates entering the central carbon metabolism via acetyl-CoA.

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