Einfluss von Salzen auf die Kationenaustauschchromatographie von Proteinen

Fuchs, Thomas Leonard; Jupke, Andreas; von Lieres und Wilkau, Eric

doi:HT031257970

Einfluss von Salzen auf die Kationenaustauschchromatographie von Proteinen = Impact of salt selection on cation-exchange chromatography of proteins

Fuchs, Thomas Leonard^RWTH*

2025

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Thomas Leonard Fuchs

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2025

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2025

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Jupke, Andreas (Thesis advisor)^RWTH* ; von Lieres und Wilkau, Eric (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2025-08-11

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2025-06915
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1016414/files/1016414.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Fluidverfahrenstechnik (416310)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Die Ionenaustauschchromatographie ist ein bedeutender Prozessschritt zur Aufreinigung von Proteinen in der biotechnologischen Industrie. Die Bedeutung der in der mobilen Phase verwendeten Salzspezies ist hierbei in der Literatur umstritten. Darüber hinaus wurde ein möglicher Einfluss von der Mischung verschiedener Salze in der Ionenaustauschchromatographie bisher nicht untersucht, obwohl Salzmischungen für die hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC) synergetische Effekte zeigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Salzeinfluss auf die Kationenaustauschchromatographie (cation-exchange chromatography [CEC]) anhand der Modellproteine bovines Serumalbumin (BSA), Lysozym (LYZ), α-Chymotrypsin (ACH) und Cytochrom C (CYC) untersucht. Hierzu wurden lineare Gradienten-Elutionen bei einem pH-Wert von 4 durchgeführt. In einem ersten Schritt wurde der Einfluss verschiedener Salzspezies auf die Proteine BSA, LYZ und ACH betrachtet. Als geeigneter Ansatz für den Vergleich des Retentionsverhaltens der Proteine bei Salzen mit unterschiedlicher Valenz wurde hierbei eine zwischen den Versuchen konstante Kationenstärke identifiziert. Es konnte demonstriert werden, dass proteinspezifische Salzeffekte häufig auftreten und einen großen Einfluss auf die Proteintrennung haben können. Hierbei war der Einfluss der Anionen auf das verwendete Modellsystem größer als der Einfluss der Kationen, obwohl die Kationen in der CEC direkt an der Ionenaustausch-Reaktion beteiligt sind. Darauf aufbauend wurden Einflüsse von Salzmischungen aus den Ionen Natrium, Ammonium, Chlorid und Sulfat auf die Modellproteine BSA und LYZ untersucht. Das Retentionsverhalten von LYZ ändert sich linear mit der Salzzusammensetzung, während bei BSA synergetische Effekte in Richtung niedriger Retentionszeiten bei Mischungen mit hohen Chlorid- und geringen Sulfat-Anteilen auftreten. Eine angepasste, semi-empirische Modellgleichung aus der Literatur war in der Lage, die Einflüsse über Ionen- und Interaktionsfaktoren zu beschreiben. Die Ausprägung dieser Effekte ist allerdings geringer als in der HIC. Des Weiteren wurde die Yamamoto-Methode angewendet, um die Gleichgewichtskonstante Keq sowie die charakteristische Ladung ν in Abhängigkeit der Salzzusammensetzung zu bestimmen. Die Verwendung der angepassten Modellgleichung zur Regression dieser Parameter führte auf Grund der hohen Sensitivität auf leichte experimentelle Abweichungen zu großen Differenzen zwischen den gemessenen und den regressierten Parameter-Werten. Die Abweichungen von Keq und ν verliefen dabei gegensätzlich und glichen sich in ihrem Einfluss aus, sodass die mit den regressierten Parametern über die Yamamoto-Gleichung berechneten Retentionszeiten sehr gut mit experimentellen Daten übereinstimmten. Für eine detaillierte Prozessmodellierung wurde ein mechanistisches Modell eingesetzt. Hierzu wurden die Simulationstools CADET-Core, CADET-Match und CADET-Process verwendet. Die Parameterbestimmung über die Yamamoto-Methode wurde mit einem inversen Fitting kombiniert, um das Trennverhalten der Proteine BSA, LYZ und CYC für beliebige Mischungen aus Natriumchlorid und Ammoniumsulfat und beliebige Gradientenlängen zu berechnen. Mit diesem Modell wurde anschließend eine Simulationsstudie zur Untersuchung des Salzeinflusses auf den Trennprozess durchgeführt. Der Nutzen von Salzmischungen für die Proteintrennung hängt bei diesem Stoffsystem stark vom betrachteten Produkt ab. Für die Aufreinigung von BSA oder von allen Proteinen in einem Schritt bringt die Verwendung von Salzmischungen große Vorteile mit sich und verbessert die Trenneffizienz signifikant, während sie für CYC und LYZ zu keiner Verbesserung des Prozesses führen. Somit wurde demonstriert, dass Salzspezies und Salzmischungen einen großen Einfluss auf die CEC von Proteinen haben können und in der Prozessentwicklung berücksichtigt werden sollten. Die hier verwendete Methodik zur Modellierung und Parameterbestimmung stellt dabei einen vielversprechenden Ansatz zur Beschreibung dieser Effekte in der mechanistischen Modellierung dar.

Ion-exchange chromatography is an important process step for the purification of proteins in the biotechnological industry. The significance of the salt type employed in the mobile phase is disputed in literature. Moreover, a possible impact of mixed salts on ion-exchange chromatography has not been investigated yet, despite the occurrence of synergetic effects of salt mixtures for hydrophobic interaction chromatography (HIC). In this work, the salt impact on cation-exchange chromatography (CEC) on the model proteins bovine serum albumin (BSA), lysozyme (LYZ), α-chymotrypsin (ACH) und cytochrome C (CYC) is investigated. Therefore, linear gradient elution experiments are conducted at a pH-value of 4. In a first step, the impact of various ion species on the proteins BSA, LYZ and ACH is studied. The use of the same cationic strength for experiments with ions of different valences was identified as a suitable approach for the comparison of salt effects. It was demonstrated that protein specific salt effects occur frequently and can have a significant impact on protein separation. For the used model system, the impact of the anion selection was higher than that of the cation selection, even though the cation directly participates in the ion-exchange process in CEC. Furthermore, the effects of mixed salts in CEC were studied for the proteins BSA and LYZ with the ions sodium, ammonium, chloride and sulfate. The retention time of LYZ changes in a linear way with the salt composition, while BSA shows synergetic effects towards shorter retention times for mixtures with chloride and low sulfate fractions. An adjusted, semi-empirical model equation from literature could describe the occurring effects with single ion factors and interaction factors. The impact of these synergetic salt effects was, however, lower in IEC than for HIC. Moreover, the Yamamoto-method was employed to determine the equilibrium constant Keq as well as the characteristic charge ν for various salt compositions. The use of the adjusted model equation for a regression of these parameters lead to high deviations between measured and regressed values, as the Yamamoto-method showed a high sensitivity for small experimental deviations. However, the deviations for Keq and ν occurred in opposite directions and canceled each other’s impact out. Thus, retention times calculated with the Yamamoto-equation and the regressed parameters showed a high agreement with experimental data. For a detailed process modeling, the mechanistic modeling tools CADET-Core, CADET-Match and CADET-Process were employed. The parameter determination by the Yamamoto-method was combined with an inverse fitting approach to calculate the chromatograms of the proteins BSA, LYZ and CYC for any salt mixtures of sodium chloride and ammonium sulfate as well as any gradient length. This tool was then used for a simulation study to investigate the impact of salt mixtures on the separation process. The benefit of employing mixed salts for this system depends on the defined product. For the purification of BSA as wells of all proteins in one separation step, the use of salt mixtures lead to a significant improvement of the process. For LYZ or CYC as products, the use of salt mixtures showed no improvement of the process. Thus, it was demonstrated that salt type and salt mixtures can have a significant impact on CEC processes for protein separation and should be investigated during process development. The method for parameter determination and modeling described in this work is a suitable approach to describe these salt effects in a mechanistic model.

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