Modellierung neuartiger Therapiestrategien mit DNA‑Reparatur‑Inhibitoren und onkolytischen Adenoviren für das plattenepitheliale Harnblasenkarzinom

Pannhausen, Julia; Gaisa, Nadine; Pradel, Gabriele; Wagner, Wolfgang

doi:HT031491575

Modellierung neuartiger Therapiestrategien mit DNA‑Reparatur‑Inhibitoren und onkolytischen Adenoviren für das plattenepitheliale Harnblasenkarzinom

Pannhausen, Julia^RWTH*

2026

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Julia Pannhausen, M. Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2026

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2026

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wagner, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH* ; Pradel, Gabriele (Thesis advisor)^RWTH* ; Gaisa, Nadine (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2026-05-05

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2026-05561
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1036533/files/1036533.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNA-Reparatur (frei) ; Hanblasenkarzinom (frei) ; Plattenepithelkarzinom (frei) ; onkolytische Virotherapie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Harnblasenkarzinom umfasst diverse histologische Subtypen, darunter das seltenere Plattenepithelkarzinom (SCC), das mit einer schlechten Prognose und limitierten therapeutischen Optionen assoziiert ist. Die Standardtherapie ist die radikale Zystektomie. Alternativ kann mit einer möglichst vollständigen transurethralen Resektion des Tumors und gleichzeitiger Chemo‑ und/oder Radiotherapie therapiert werden, worauf jedoch nur < 50 % der Patienten langfristig ansprechen, da z.B. Rezidive und Resistenzen auftreten können. Somit ist der klinische Bedarf zur Identifizierung, Charakterisierung und Entwicklung neuer Therapieoptionen beim SCC groß und hochrelevant. In dieser Arbeit konnten mit der Strategie der radiosensibilisierenden Inhibition der DNA damage response (DDR) sowie der XVir‑N‑31‑basierten onkolytischen Virotherapie zwei (neo‑)adjuvante Therapieansätze für muskelinvasive Harnblasenkarzinome unter anderem für das SCC untersucht werden. Grundlage hierfür war die aufwendige Etablierung gut charakterisierter, muskelinvasiver patientenabgeleiteter ex vivo Harnblasenkarzinom‑Modelle, die eine fundierte und Patienten‑nahe Untersuchung insbesondere im SCC ermöglichten. Im ersten Ansatz, aufbauend auf bereits publizierten in vitro Daten (Chughtai, Pannhausen et al. 2022), wurde eine Auswahl zentraler DDR‑Proteine (DNA‑PK, POLQ und ATR) als Zielstruktur für den Einsatz neuartiger Inhibitoren genutzt. Experimente mittels etablierter ex vivo Zellkulturen demonstrierten eine signifikante Steigerung der radiotherapeutischen Effizienz durch den DNA-PK-Inhibitor AZD7648, während die Wirkung des POLQ-Inhibitors ART558 vergleichsweise gering ausfiel (publiziert, 11/2025, Die Pathologie, non-peer-reviewed). In einer Vielzahl der Analysen zeigte sich jedoch insgesamt der ATR-Inhibitor (ATRi) Ceralasertib als der effektivste Radiosensibilisierer. In Kombination mit Bestrahlung reduzierte die ATR‑Inhibition z.B. die XTT‑IC50‑Werte (< 1 µM) sowie das klonogene Überleben (−46 bis −92 %) infolge deutlich eingeschränkter DNA‑Reparatur (−22 bis −60 %), nachgewiesen durch γH2AX/Comet‑Färbung. Zwecks Entschlüsselung von ATRi induzierten Resistenzmechanismen, die zugleich Hinweise auf synthetisch letale Abhängigkeiten liefern könnten, wurden im Folgenden ATRi‑Resistenzmodelle auf Basis von in vitro und ex vivo SCC‑Zellkulturlinien etabliert. Eine umfassende Charakterisierung (RNA‑Sequencing, EPIC‑/Kinase‑Array) ATRi‑resistenter Zellen verwies zunächst auf eine Vielzahl von zellulären und molekularen Veränderungen, wie z.B. einer epigenetisch‑bedingten Modulation der Tumorimmunität im Zuge der Langzeit ATR‑Inhibition. Der Einfluss auf den Tumor‑Immunzell‑Crosstalk konnte experimentell mittels PBMC‑Co‑Kulturen in vitro bestätigt werden. Zugleich wurden in ATRi‑resistenten Tumorzellen distinkte DDR‑Signalwege kompensatorisch heraufreguliert, darunter zentrale Komponenten der homologen Rekombinationsreparatur wie BRCA1 oder RAD51. Eine pharmakologisch induzierte Blockade der homologen Rekombination mittels RAD51‑Inhibitor B02 führte hingegen zu einer Re‑Sensitivierung ATRi resistenter Zellen ex vivo und in ovo und legt eine synthetische Letalitätsbeziehung zwischen ATR und HR nahe. Dies ergänzt den bekannten Befund, dass HR‑defiziente Tumore besonders sensitiv auf ATR‑Inhibition reagieren, was ATR als therapeutisches Ziel/Marker hervorhebt (publiziert 12/2025, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research). Als zweite Strategie wurde die onkolytische Virotherapie untersucht, die für das Harnblasenkarzinom bereits eine vielversprechende Behandlungsoption darstellt. So erhielt das onkolytische Virus Creostimogene grenadenorepvec (CG0070) von der FDA den Breakthrough- und Fast-Track-Status für die Therapie des nicht-muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms. Für muskelinvasive Urothelkarzinome konnte die Wirksamkeit des onkolytischen Adenovirus XVir‑N‑31 bereits in Vorarbeiten in vitro und in vivo in einem humanisierten Mausmodell demonstriert werden (Lichtenegger et al. 2019). XVir‑N‑31 repliziert selektiv in Tumorzellen mit hoher Expression des Y-Box-Bindeproteins 1 (YB-1), führt dort zur Lyse und verschont dabei gesundes Gewebe. In dieser Arbeit wurde erstmals das Potenzial von XVir‑N‑31 für SCC analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass SCC besonders geeignet für eine XVir‑N‑31-basierte Virotherapie ist, da YB-1 signifikant hochreguliert war. Dies wurde sowohl auf Ebene der mRNA-Expression durch TCGA-Analyse (n = 315) als auch durch immunhistochemische Färbungen von SCC Tissue-Microarrays (n = 89) bestätigt. In vitro und ex vivo erzielte XVir‑N‑31 hohe Infektions- und Replikationsraten (Titer < 1,8 × 10^6 pfu/mL) sowie ausgeprägte zytotoxische Effekte (MOI < 50) in in vitro und ex vivo SCC-Zellkulturen. Ergänzend zeigten in ovo SCC‑Xenograft‑Modelle eine Hemmung des Tumorwachstums von bis zu 49 % (publiziert 04/2025, Scientific Reports). Zusammenfassend handelte es sich bei beiden Forschungsansätzen um präklinische in vitro, ex vivo und in ovo Arbeiten, die für die Behandlung mit ATR-Inhibitoren und XVir‑N‑31 eine wichtige Grundlage für weiterführende Untersuchungen bieten. Besonders im Hinblick auf ATR-Inhibitor Ceralasertib tragen die durch diese Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zu einem besseren Verständnis der DDR‑Mechanismen und deren Relevanz für innovative therapeutische Ansätze beim Harnblasenkarzinom bei. Explizit für das seltene, schwer therapierbare und prognostisch ungünstige SCC konnten vielversprechende (neo‑)adjuvante Optionen aufgezeigt werden. Damit leisten die Ergebnisse dieser Arbeit einen Beitrag zur Entwicklung innovativer Therapieoptionen für das muskelinvasive Harnblasenkarzinom.

Bladder cancer (BLCA) comprises various histological subtypes, including rarer squamous cell carcinoma (SCC), which is associated with poor prognosis and limited therapeutic options. The current standard of care is radical cystectomy. Alternatively, therapy may involve maximal transurethral resection of the tumor combined with concurrent chemo- and/or radiotherapy. However, less than 50 % of patients achieve long‑term benefit from this approach, largely due to recurrence and the development of therapy resistance. Consequently, there is a considerable and clinically relevant need to identify, characterize, and develop novel therapeutic strategies for SCC.In this work, two (neo‑)adjuvant therapeutic approaches for muscle-invasive bladder cancer, including SCC, were investigated: radiosensitizing inhibition of the DNA damage response (DDR) and XVir‑N‑31-based oncolytic virotherapy. These approaches were based on the development of well‑characterized, patient‑derived ex vivo models, which enabled thorough and patient‑relevant investigation, particularly of SCC. The first approach, based on published in vitro data (Chughtai, Pannhausen et al., 2022), targeted central DDR proteins (DNA‑PK, POLQ, and ATR) with novel inhibitors. Experiments using established ex vivo cell cultures demonstrated a significant increase in radiotherapeutic efficacy of DNA-PK inhibitor AZD7648, whereas the effect of POLQ inhibitor ART558 was comparatively modest (published, 11/2025, Die Pathologie, non-peer-reviewed). Notably, the ATR inhibitor (Ceralasertib) emerged as the most effective radiosensitizer in multiple analyses. In combination with radiotherapy, ATRi reduced XTT‑IC50 values (< 1 µM) and clonogenic survival (−46 to −92 %) by significantly impairing DNA repair, as demonstrated by γH2AX/comet staining (+22 to +60 %). To decipher mechanisms of ATRi‑induced resistance, which may also reveal synthetic lethal dependencies, in vitro and ex vivo ATRi‑resistance models of SCC were established. Comprehensive characterization (RNA‑sequencing, EPIC/Kinase arrays) of resistant cells uncovered numerous molecular and cellular changes, including epigenetically driven modulation of tumor immunity during long‑term ATR inhibition. Functional effects on tumor–immune cell crosstalk were confirmed in PBMC co‑culture experiments in vitro and ex vivo. Additionally, resistant cells showed compensatory upregulation of distinct DDR pathways, most notably homologous recombination repair (HR) by upregulation of HR‑factors like BRCA1 and RAD51. Pharmacological blockade of homologous recombination using the RAD51 inhibitor B02 restored ATRi sensitivity in ex vivo and in ovo models, suggesting a synthetic lethal relationship between ATR and HR. This confirmed and extended the literature finding that HR‑deficient tumors are particularly sensitive to ATR inhibition, stressing ATR potential as a therapeutic target and marker (published 12/2025, Journal of Experimental & Clinical Cancer Research). The second strategy focused on oncolytic virotherapy, which already represents a promising therapeutic option for bladder cancer. For instance, the oncolytic virus cretostimogene grenadenorepvec (CG0070) has been granted breakthrough and fast-track designation by the FDA for the treatment of non-muscle-invasive bladder cancer. With previous studies in muscle-invasive urothelial carcinoma, the efficacy of the oncolytic adenovirus XVir‑N‑31 has already been demonstrated in vitro and in vivo in a humanized mouse model (Lichtenegger et al. 2019). The oncolytic adenovirus XVir‑N‑31 replicates selectively in tumor cells with high expression of Y-box binding protein 1 (YB-1), induces lysis, while not harming normal tissue. In this study, the potential of XVir‑N‑31 was analyzed for the first time in bladder SCC. SCC was particularly responsive to XVir‑N‑31 due to significantly higher YB‑1 expression levels. This was confirmed both at the mRNA expression level through TCGA analysis (n = 315) and by immunohistochemical staining of SCC tissue microarrays (n = 89). In vitro and ex vivo, XVir‑N‑31 achieved high infection and replication rates (titer < 1,8 × 10^6 pfu/mL) and induced cytotoxic effects (MOI < 50) in SCC in vitro and ex vivo cell cultures. In ovo SCC xenografts demonstrated up to 49 % tumor growth inhibition (published 04/2025, Scientific Reports). In conclusion, both approaches represent preclinical in vitro, ex vivo, and in ovo studies, with ATR inhibitor and XVir‑N‑31 treatment, providing a valuable basis for future research. In particular, the findings related to the ATR inhibitor Ceralasertib offer new insights into DDR mechanisms and their relevance for innovative therapeutic strategies in bladder cancer but also reveal promising (neo‑)adjuvant options for the rare, therapeutically challenging, and prognostically unfavorable SCC. Thus, this work contributes to the development of innovative treatment strategies for muscle‑invasive bladder cancer.

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