Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Interaktionen mittels der Festkörper-NMR-Spektroskopie

Wehr, Nina; Herrmann, Andreas; Wiegand, Thomas

doi:HT031567032

Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Interaktionen mittels der Festkörper-NMR-Spektroskopie

Wehr, Nina^RWTH*

2026

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Nina Wehr, M. Sc.

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2026

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen

Dissertation, RWTH Aachen University, 2026

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wiegand, Thomas (Thesis advisor)^RWTH* ; Herrmann, Andreas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2026-07-15

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2026-07522
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/1039870/files/1039870.pdf

Einrichtungen

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Interaktionen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren stehen im Zentrum von verschiedensten biochemischen Prozessen darunter der DNA- und RNA-Metabolismus. Sie spielen aber auch in vielen weiteren Protein-katalysierten Reaktionen eine wichtige Rolle, da diese in vielen Fällen mit der Hydrolyse des Nukleotids ATP einhergehen. In dieser Arbeit werden verschiedene Strategien zur Untersuchung dieser Interaktionen mittels der Festkörper-NMR-Spektroskopie vorgestellt. In den ersten beiden Abschnitten (Kapitel 3 und 4) liegt dabei der Fokus auf der direkten Detektion des Protein-gebundenen Nukleotids. In Kapitel 3 wurde eine Strategie zur Untersuchung der Protein-katalysierten ATP-Hydrolyse in der ATPase SmsC entwickelt. Dabei wurden verschiedene Analoga verwendet, um die einzelnen Abschnitte der ATP-Hydrolyse zu stabilisieren, wodurch eine individuelle Untersuchung der einzelnen Reaktionsabschnitte ermöglicht wurde. Dabei zeigen die 1H-31P CP-Experimente konformationelle Heterogenitäten des gebundenen Nukleotids. Durch eine Kombination dieser Information mit modellierten Strukturen der untersuchten Komplexe war es möglich, für die Nukleotidbindung elementare Wasserstoffbrückenbindungen zu identifizieren. Außerdem konnten durch die Bestimmung der homonuklearen 31P-31P Dipolkopplungskonstante Rückschlüsse auf die Dynamiken der gebundenen Nukleotide gezogen werden. Dies ermöglichte es im Fall der ATPase SmsC, den genauen Moment während der ATP-Hydrolyse zu postulieren, in dem eine Konformationsänderung von einem offenen in einen geschlossenen Zustand vonstattengeht. In Kapitel 4 wurde ein besonderer Fokus auf die Untersuchung des Überganszustandes der ATP-Hydrolyse gelegt. Dafür wurde die Helikase HpDnaB mit gebundenem ADP:AlF4– verwendet. Die Bestimmung der 31P-27Al Dipolkopplungskonstanten von ADP:AlF4– erlaubte es, den internuklearen P-Al Abstand zu bestimmen und daraus Informationen über das genaue Reaktionsstadium zu erhalten, welches von dem Analogon gebunden an HpDnaB dargestellt wird. In den darauffolgenden beiden Abschnitten (Kapitel 5 und 6) liegt der Fokus auf einer Protein-detektierten Strategie, bei der das Protein in 13C- und 15N-isotopenmarkierter Form vorliegt und direkt mittels der Festkörper-NMR-Spektroskopie detektiert werden kann. In Kapitel 5 wird dabei die Interaktion zwischen der Amyloidfibrille VAQAQINI und verschiedenen Nukleinsäurestrukturen mittels 13C-31P und 15N-31P Korrelationsexperimenten bei moderaten MAS-Frequenzen von 17 kHz untersucht. Diese Experimente implizieren räumliche Nähe zwischen der Fibrille und den Phosphaten der Nukleinsäure und erlauben dadurch die Identifikation der Nukleinsäurebindungsstelle in der Fibrille. Im Zuge dessen konnte die besondere Rolle des positiv geladenen N-terminus in der Bindung der Nukleinsäurestrukturen identifiziert werden. In Kapitel 6 werden diese Experimente um 1H-detektierte Experimente bei schnellen MAS-Frequenzen von 100 kHz ergänzt. Diese Experimente ermöglichen zusätzlich zur Identifikation der Bindungsstelle auch eine Untersuchung der zugrunde liegenden nicht-kovalenten Wechselwirkungen. Da diese Wechselwirkungen in der Regel über die Protonen verlaufen, ist die direkte Detektion der 1H-Kerne dafür unerlässlich. Dadurch war es möglich das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk der R309 Seitenkette der Primase aus dem Plasmid pRN1 zu erkennen und die Veränderungen der Wasserstoffbrückenbindungen während der verschiedenen Schritte der von der Primase katalysierten Dinukleotidbildung nachzuverfolgen. Im letzten Abschnitt (Kapitel 7) werden DNA-NFs untersucht, wobei es sich um große amorphe DNA-Strukturen handelt. Dabei werden US induzierte Bindungsbrüche mittels einer Kombination verschiedener NMR-Techniken im Festkörper und in Lösung nachvollzogen.

Interactions between proteins and nucleic acids are at the center of different biochemical processes such as DNA and RNA metabolism. They also play an important role in many further protein-catalyzed reactions, since those are often accompanied by the hydrolysis of the nucleotide ATP. In this work different strategies for investigating those interactions using solid-state NMR are introduced. In the first two parts (chapter 3 and 4) the focus lies on the direct detection of the protein-bound nucleotide. In chapter 3 a strategy was developed to investigate the protein-catalyzed ATP-hydrolysis in the ATPase SmsC. For this, different analogues were used to stabilize the individual steps of ATP hydrolysis, enabling an investigation of individual reaction steps. Here the 1H-13C CP experiments show conformational heterogeneity of the bound nucleotide. By combining this information with modelled structures of the investigated complexes it was possible to identify hydrogen bonds, which are essential for nucleotide binding. Furthermore, by determining the homonuclear 31P-31P dipole coupling constant it was possible to obtain information about the dynamics of the bound nucleotide. In case of the ATPase SmsC, this enabled to postulate the exact moment during ATP hydrolysis, where the protein changes between an open and closed conformation. Chapter 4 focuses on the transition state of ATP hydrolysis. For this the helicase HpDnaB with bound ADP:AlF4– was used. The determination of the 31P-27Al dipole coupling constant of ADP:AlF4– allowed the determination of the internuclear P-Al distance and yielded information about the exact reaction state, which is mimicked by the analogue bound to HpDnaB. The following two parts (chapter 5 and 6) focus on a protein-detected strategy, where the protein is labeled with 13C and 15N isotopes and directly detected with solid-state NMR. In chapter 5 the interaction between the amyloid fibril VAQAQINI and different nucleic acid structures is investigated by using 13C-31P and 15N-31P correlation experiments at moderate MAS frequencies of 17 kHz. These experiments implicate a spatial proximity between the fibril and the phosphates of the nucleic acid and allow the identification of the nucleic acid binding site in the fibril. In the course of this study the special role of the positively charged N-terminus for the binding of nucleic acid structures was identified. In chapter 6 those experiments are complemented by 1H-detected experiments at fast MAS frequencies of 100 kHz. In addition to the identification of the binding site, those experiments enable the investigation of non-covalent interactions involved in nucleotide binding. The direct detection of 1H-nuclei is necessary, since those interactions are typically mediated by protons. Thereby it was possible to spot the hydrogen bond network of the R309 side chain in the primase of the plasmid pRN1 and to follow the changes in the hydrogen bond network during the different steps of the primase-catalyzed dinucleotide formation. In the last part (chapter 7) DNA-NFs are investigated, which are large amorphous DNA structures. Here US-induced bond breakages are tracked using a combination of different NMR-techniques in the solid state and in solution.

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