Molecular mechanisms of signal transduction in two-component signaling systems

Ishchenko, Andrii; Gordeliy, Valentin

doi:0366-0885

Molecular mechanisms of signal transduction in two-component signaling systems = Molekulare Mechanismen der Signaltransduktion in Zweikomponentensignalsystemen

Ishchenko, Andrii (Author)

2013

VerantwortlichkeitsangabeAndrii Ishchenko

ImpressumJülich : Forschungszentrum Jülich, Zentralbibl., Verl. 2013

Umfang115 S. : Ill., graph. Darst.

ReiheBerichte des Forschungszentrums Jülich ; 4362

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak05

Hauptberichter/Gutachter
Gordeliy, Valentin (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-05-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-45932
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/230015/files/4593.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Protein-Histidin-Kinasen (Genormte SW) ; Kristallographie (Genormte SW) ; Membranproteine (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; histidine kinases (frei) ; crystallography (frei) ; membrane proteins (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570
rvk: WD 2200

Kurzfassung
Zweikomponenten-Signaltransduktionsproteine sind eine wichtige Proteinklasse. Anders als bei Eukaryoten kommt in den meisten Prokaryoten bei der Signaltransduktion ein Schema des Phosphattransfers zum Tragen, an dem zwei konservierte Proteinkomponenten beteiligt sind: eine Histidinkinase und ein Antwortregulator. Diese Systeme dienen als einfacher Mechanismus der Kopplung zwischen Stimulus und Antwort, der es Organismen erlaubt, Veränderungen verschiedener Umweltbedingungen wahrzunehmen und auf sie zu reagieren. Obwohl bei der Erforschung der Signaltransduktion in Zweikomponentensystemen in letzter Zeit viele Fortschritte gemacht wurden, besteht noch immer ein großer Bedarf an zuverlässigen Modellsystemen, mit denen die molekularen Mechanismen der Signaltransduktion untersucht werden können. Ein aus zwei Membranproteinen – dem sensorischen Rhodopsin II (SRII) und dem zugehörigen Transducer (HtrII) – bestehender Komplex in dem Halobakterium N. pharaonis ist ein Beispiel für ein solches System. Als Phototaxis-Rezeptor hilft dieser Komplex Halobakterien bei der Vermeidung schädlichen UV-Lichts. Das Sensor Rhodopsin II gehört zur Familie der archaealen Retinalproteine. HtrII weist eine starke Homologie zu bakteriellen Chemorezeptoren auf. Es besteht aus einer Transmembrandomäne, einem Linkerbereich, einer Methylierungsdomäne, die an der Adaption beteiligt ist, und einer Kinasedomäne. Die Röntgenstrukturen von SRII/HtrII geben einen einzigartigen Einblick in den Komplex aus zwei Transmembranproteinen. Diese Strukturinformationen erklären die ersten Schritte der Signaltransduktion in SRII und einen möglichen Mechanismus der Signalübermittlung an HtrII. NMR-Strukturinformationen der zytoplasmatischen Domäne des osmosensorischen EnvZ aus E. coli zeigen den Aufbau der Kinasedomäne. Obwohl mehrere Strukturinformationen vorliegen, sind die Details der Funktionsweise des Komplexes auf molekularer Ebene, von der Isomerisierung des Retinals zum Übergang einer Phosphatgruppe zur Kinase CheA, noch immer unbekannt. Diese Arbeit soll einen Beitrag zur Aufklärung einiger dieser Schritte leisten und mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse die wichtigsten Eigenschaften von Proteinstrukturen zeigen, die eine effiziente Signaltransduktion möglich machen. Der Mechanismus der Signaltransduktion weist bei allen halobakteriellen Retinalproteinen einige Gemeinsamkeiten auf. Eine dieser Gemeinsamkeiten ist ein Protonentransfer von der SchiffBase zum Gegenion, der nach der Isomerisierung des Retinals stattfindet. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Mutation des Gegenions zu einem neutralen Aminosäurerest in vielen Fällen kritisch für die Funktion ist. Im Fall des SRII/HtrII-Komplexes haben physiologische Versuche gezeigt, dass die Mutation von Asp75 zu Asn75 die Signaltransduktion, die als persistente Rate der Umkehrung von Zellbewegungen bei Lichteinfall gilt, nicht hemmt. Diese Tatsache ist wichtig, um den Mechanismus der Signaltransduktion in diesen Systemen zu verstehen. Die in dieser Arbeit beschriebene Struktur zeigt die Veränderung im Wasserstoffnetzwerk vom SRII-D75N/HtrII-Komplex im Vergleich zum Wildtyp-Komplex. Ein Vergleich mit dem Grundzustand und dem M-Zustand des Wildtyps konnte Hinweise darauf geben, wie die Signaltransduktion in der D75N-Proteinvariante möglicherweise abläuft. Die intensive Kristallisierung unter verschiedenen Bedingungen hat zu einem weiteren Ergebnis geführt, das für das Verständnis des Funktionsmechanismus ebenfalls von großer Bedeutung sein könnte. Es wurden Kristalle hergestellt, die unterschiedliche Raumgruppen aufwiesen, und die Strukturinformationen für diese Raumgruppen wurden mit den vorher veröffentlichen Daten zur Raumgruppe P21212 verglichen. Dabei wurde ein auffallender Unterschied in der Anordnung der SRII- und HtrII-Proteine innerhalb des Komplexes festgestellt. Während die Proteine in der Raumgruppe P21212 einen „Spalt” bilden, der zur zytoplasmatischen Seite hin offen ist („V-Form”), sind sie in der neuen Struktur der Raumgruppe I212121 etwa parallel angeordnet („U-Form”). In dieser Arbeit wird diskutiert, welche der Quartärstrukturen des Komplexes den in vivo vorkommenden funktionalen Komplex darstellt. Histidinkinasen sind ein weiteres Beispiel für Zweikomponentensysteme zur Signaltransduktion. NarQ und NarX sind solche Histidinkinasen, die als Rezeptor für Nitrat und Nitrit dienen, d. h. auf diese Substanzen reagieren, um die anaerobe Atmung in verschiedenen Bakterien zu regulieren. Diese Arbeit zeigt einige Ansätze, die bei der Untersuchung dieser sehr wichtigen Proteine zur Anwendung kommen können. Dazu wurden zunächst Kristalle gewonnen. Die Membrandomäne des Nitrat/Nitrit-Rezeptors NarQ aus E. coli wurde erfolgreich exprimiert, gereinigt und kristallisiert. Derzeit erfordern diese Kristalle jedoch noch weitere Optimierung.

Two-component signaling systems is an important class of proteins. In contrast to eukaryota, most prokaryotic signal transduction pathways use schemes of phosphate transfer involving two conserved components, a histidine protein kinase and a response regulator protein. To the moment, hundreds of such systems were found in eubacteria, archaea, and a few eukaryotic organisms. These systems serve as a basic stimulus-response coupling mechanism to allow organisms to sense and respond to changes in many different environmental conditions. Though many advances in the field of signal transduction in two-component signal transduction have been made recently, there is still a strong demand for robust model systems where molecular mechanism of signal transduction can be studied. The complex of two membrane proteins from Halobacterium N.pharaonis, Sensory Rhodopsin II (SRII) with its cognate Transducer (HtrII) is an example of such system. It is serving as a phototaxis receptor that helps halobacteria to avoid harmful UV light. Sensory rhodopsin II belongs to the family of archaeal retinal proteins. HtrII is highly homologous to bacterial chemoreceptors. It consists of transmembrane domain, linker domain, methylation region involved in adaptation and kinase domain. The X-Ray structures of SRII/HtrII give a unique insight into the complex of two transmembrane proteins. These structures elucidate initial steps of signal transduction in SRII and possible mechanism to transfer the signal to HtrII. NMR structures of cytoplasmic domain of osmotic sensor EnvZ from E.coli have shown the design of kinase domain that is highly conserved among all histidine kinases. Despite some structural information available there is still no detailed molecular mechanism of functioning of the complex from the initial step of retinal isomerization to phosphate group transition to the kinase CheA. This work is aimed to elucidate some of these steps in more detail and to show by means of X-Ray structural analysis the key features of protein structures that are prerequisite for efficient signal transduction. All halobacterial retinal proteins share common features of the signal transduction mechanism. One of these features is a proton transfer from the Schiff base to the counterion after retinal isomerization. Various studies have shown that the mutation of the counterion to a neutral amino acid residue is critical for the function of most of them. In the case of SRII/HtrII complex, physiological experiments have shown that Asp75-to-Asn75 mutation doesn’t inhibit the signal transduction that is seen as persistent rate of cell motion reversals upon light illumination. This fact is important for understanding signal transduction mechanism in these systems. The structure described in this thesis shows the change in the hydrogen network of SRII-D75N/HtrII complex with respect to the wild type complex. Comparison with the ground and M states of the wild type has helped to elucidate how the signal transduction process might evolve in the D75N mutant protein. Intense crystallization under various conditions has resulted into another finding that might be very important for understanding of the mechanism of functioning. Crystals of different space groups were produced and the structures in these space groups were compared to the previously published structures in the P21212 space group. A striking difference in the arrangement of the SRII and HtrII proteins in the complex were observed. Whereas in the P21212 space group the proteins form a crevice with an opening towards cytoplasmic side (“V”-shape), in newly obtained structure of I212121 space group proteins are roughly parallel to each other (“U”-shape). This thesis contains a discussion about which of the quaternary structures of the complex represents the functional complex that occurs in vivo. Histidine kinase chemoreceptors are another representative of two-component signal transduction systems. NarQ and NarX belong to the family of histidine kinase receptors and react to nitrate or nitrite to regulate anaerobic respiration in various bacteria. This study has revealed some approaches that can be used in studying these very important proteins. First crystals were obtained. The membrane domain of the nitrate/nitrite receptor NarQ from E.coli was successfully expressed, purified and crystallized. At the moment these crystals require additional optimization.

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