Establishing the interaction between the CC chemokine ligand 5 and the receptors CCR1 and CCR5

Kramp, Birgit K.; Koenen, Robert Ryan

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-49240

Establishing the interaction between the CC chemokine ligand 5 and the receptors CCR1 and CCR5 = Herstellung der Interaktion zwischen dem Chemokin CCL5 und den Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR5

Kramp, Birgit K. (Author)

2013 & 2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Birgit Kramp

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangX, 109 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache. - Prüfungsjahr: 2013. - Publikationsjahr: 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Koenen, Robert Ryan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-12-04

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-49240
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/231006/files/4924.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Molekulare Herz-Kreislaufforschung (N.N.) (531010-3)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Chemokine (Genormte SW) ; Ligand <Biochemie> (Genormte SW) ; RANTES (Genormte SW) ; Wechselwirkung (Genormte SW) ; CCR5-Rezeptor (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; CCL5 (frei) ; CCR1 (frei) ; Chemokininteraktion (frei) ; Interaktion (frei) ; später (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Chemokine sind bedeutende Mediatoren und Regulatoren der Leukozyten-Migration und spielen dadurch eine wichtige Rolle bei der Entstehung verschiedener entzündlicher Erkrankungen. Das proinflammatorische Chemokin CCL5 oder auch RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) ist für die Entstehung zahlreicher Krankheiten von besonderer Relevanz. Es konnte gezeigt werden, dass die durch CCL5 vermittelte Adhäsion monozytärer Zellen auf entzündlichem Endothel durch das Zusammenwirken mit CXCL4 verstärkt wurde. Da dieser Synergismus der Dimerisierung von CXCL4 mit CCL5 zugeschrieben werden konnte, wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die strukturellen Grundlagen der Heterodimer Bildung untersucht. Diese Interaktion wurde mit Hilfe der 15N-1H HSQC (von „heteronuclear single quantum coherence“) Kernspinresonanzspektroskopie untersucht. Dazu wurde 15N angereichertes CCL5 rekombinant in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. Die HSQC-Spektren zeigten chemische Verschiebungen insbesondere in den N-terminalen Aminosäuren von CCL5, was eher auf eine CC denn auf eine CXC typische Interaktion hindeutet. Im Rahmen dieser Studie wurden kleine antagonistische Peptide entwickelt und synthetisiert, CKEY2 und dessen Maus Ortholog MKEY, welche die Heterodimer Bildung von CXCL4 und CCL5 unterbinden. Um Ihre pharmakologische Wirksamkeit zu ermitteln wurde der Einfluss von MKEY auf die Leukozyten-Adhäsion an entzündlichem Endothel untersucht. Zum Vergleich und als Kontrolle wurde Met-CCL5, ein Rezeptor-Antagonist für CCR1 und CCR5, eingesetzt. Met-CCL5 wurde dazu kloniert, rekombinant exprimiert und mit Hilfe von FPLC und HPLC Methoden aufgereinigt. Dabei zeigte sich in Gegenwart von MKEY eine deutlich verminderte Adhäsion von Leukozyten. Darüber hinaus legte der Vergleich mit Met-CCL5, die Vermutung nahe, dass es sich bei CCR1 und/oder CRR5 um den Rezeptor für das CXCL4/CCL5 Heteromer handelt. Die Chemokin-Rezeptoren CCR1 und CCR5 sind sich in Struktur und auch Aminosäuresequenz sehr ähnlich. Abgesehen von dieser ausgeprägten Homologie konnte gezeigt werden, dass sie, durch CCL5 induziert, distinkte Funktionen vermitteln. CCR1 vermittelt verstärkt Arrest und CCR5 scheint in höherem Maße für die transendotheliale Migration verantwortlich. Um untersuchen zu können welche Rezeptor Domänen für diese funktionelle Selektivität von Bedeutung sind, wurden CCR5 Varianten mit bestimmten extrazellulären Domänen von CCR1 konstruiert, L1.2 und HEK-293 Zellen stabil transfiziert und ihre Funktion nach Stimulation mit CCL5, verschiedenen CCL5 Mutanten oder zusammen mit CXCL4 in Chemotaxis und Zell Arrest Experimenten untersucht. Dazu wurden zunächst CCL5, CCL5-40s und CCL5-E66A rekombinant exprimiert und aufgereinigt. Wir konnten zeigen dass, die Oligomer Bildung für alle Rezeptor Varianten zur Vermittlung der Zelladhäsion unter laminaren Flussbedingungen von Bedeutung ist. CCL5 Mutanten mit Defekten bei der Oligomerisierung (z.B. CCL5-E66A) waren nicht in der Lage einen sichtbaren Arrest zu induzieren. Darüber hinaus konnten wir feststellen, dass die 40s Domäne für den CCL5 vermittelten Zellarrest sowohl für CCR1 als auch CCR5 von Bedeutung ist. Die 50s Domäne von CCL5 hingegen scheint nur von größerer Relevanz für den CCR5 vermittelten Zellarrest zu sein, da CCR1 normal auf CCL5 mit einem mutierten 50s Motiv reagiert, wohingegen CCR5 exprimierende Zellen keine Adhäsion zeigen. Wenn allerdings die N-terminale Domäne von CCR5 gegen die von CCR1 ausgetauscht wurde, zeigte die daraus resultierende Chimäre ein mit CCR1 vergleichbares Verhalten. Dies ließ uns vermuten, dass der N-terminus von CCR5 mit 50s Motiv von CCL5 zu interagieren scheint. Der synergistische Einfluss von CXCL4 auf den CCL5 vermittelten Zellarrest wurde nur bei Zellen, die ausschließlich CCR1 exprimierten beobachtet. Eine Chimäre, bei der die dritte extrazelluläre Domäne von CCR5 durch die von CCR1 ersetzt wurde, reagierte wiederum signifikant auf den CXCL4/CCL5 Hetero-Komplex im Vergleich zu CCL5. Diese Ergebnisse konnten in Kontrollexperimenten mit entsprechenden Umkehrmutanten weiter verifiziert werden. Darüber hinaus konnten wir die Heteromerisierung von CCR1 und CCR5 zeigen, und dass sowohl das CCL5 Signal als auch das Signal des CXCL4/CCL5 Komplexes durch G alpha i in THP Zellen vermittelt wird. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass die extrazellulären Regionen der Rezeptoren CCR1 und CCR5 distinkte und definierte Funktionen bei der Interaktion mit und der Aktivierung durch CCL5 haben. Im dritten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Sialyltransferase ST3Gal-IV auf die Interaktion von CCL5 mit seinen Rezeptoren untersucht. Dazu wurden Neutrophile und Monozyten aus ST3Gal-IV defizienten und Kontroll Mäusen isoliert und in funktionellen Experimenten verglichen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass eine fehlende Sialylierung die CCL5-Rezeptor-Aktivierung nicht beeinträchtigt, da CCL5 in ST3Gal-IV defizienten und wt Zellen gleichermaßen Calcium mobilisieren konnte. Wohingegen die Adhesion von ST3Gal-IV-/-Zellen deutlich beeinträchtigt war. Unsere Ergebnisse stützen frühere Veröffentlichungen die eine besondere Bedeutung von ST3Gal-IV bei der Generierung funktioneller Selektine gezeigt haben.

Chemokines are important mediators and regulators of leukocyte trafficking, therefore, they play a crucial role in the development of inflammatory diseases. CCL5 or RANTES (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted) is a chemokine of relevance to many diseases. Moreover, CCL5-induced monocyte adhesion to inflamed endothelium was shown to be improved in the presence of CXCL4 (Platelet Factor 4). Since this synergy could be attributed to heterodimer formation, the first section of the present study surveys the structural interaction of CCL5 with CXCL4. The interaction was monitored employing the 15N-1H heteronuclear single quantum coherence (HSQC) nuclear magnetic resonance (NMR) technique. For this purpose, 15N-enriched CCL5 was recombinantly expressed in E. coli and subsequently purified. In HSQC spectroscopy, chemical shift changes were mainly observed in the N-terminal residues, which pointed toward a CC-type rather than a CXC-type interaction. Furthermore, small peptide antagonists, inhibiting the CXCL4/CCL5 dimerization, were designed (CKEY2 and the mouse orthologue MKEY). To investigate their pharmacological potential, the influence of MKEY on leukocyte adhesion to activated endothelium was monitored using intravital microscopy. As a control Met-CCT5, a strong antagonist for CCR1 and CCR5, was cloned, expressed and purified employing FPLC and HPLC techniques. Leukocyte recruitment was severely impaired in the presence of MKEY, compared to a control peptide (sMKEY) and in a similar range of Met-CCL5 which encourages the assumption that the synergy is mediated via the receptors CCR1 and/or CCR5. Despite all similarities, CCR1 and CCR5 were shown to mediate distinct functions when bound to CCL5, CCR1 rather mediates arrest and CCR5 appears to be more responsible for transendothelial migration. To establish which domains are important for this functional selectivity, we constructed different CCR5 variants with the distinct extracellular regions of CCR1. These chimeras were stably expressed in L1.2 and HEK293 cells and we investigated their function in response to CCL5, different CCL5 mutants, or together with CXCL4 using chemotaxis and cell arrest assays under laminar flow. First of all, CCL5, CCL5 40s and CCL5-E66A were recombinantly expressed and purified employing FPLC and HPLC techniques. By implementing CCL5 mutants (e.g. CCL5-E66A) with oligomerization defects in laminar flow assays, we were able to show that all receptor variants require oligomerization of CCL5 in order to function properly. In addition, our results reveal that the 40S loop of CCL5 is important for both the CCR1- and CCR5-mediated cell arrest. The 50s loop of CCL5, however, appeared to have a strong preference for CCR5 in inducing cell arrest, since CCR1 responded normal towards CCL5 50s and CCR5 being non-responsive. When the N-terminal domain of CCR5 was exchanged for that of CCR1, the resulting chimera was fully responsive towards CCL5 50s, suggesting that the N-terminal region of CCR1 interacts with the 50s domain of CCR5. The synergistic effect of CXCL4 on CCL5 induced cell arrest was observed in cells exclusively expressing CCR1 when compared to cells expressing CCR5. When the third extracellular loop of CCR1 was engineered into CCR5, the resulting chimeric receptor showed a significant response to the CXCL4/CCL5 heterocomplex, compared to CCL5 alone. These results were confirmed by constructing CCR1-based reverse chimeras for the N-terminal domain and the third extracellular loop. Furthermore we could show the heterodimerization of CCR1 and CCR5 and the synergy of the CXCL4/CCL5 complex is in THP-1 cells mediated via Gαi. In conclusion these results indicate that the extracellular regions of CCR1 and CCR5 have distinct and defined functions in leukocyte recruitment in response to CCL5. In the third section of this thesis the role of the sialyltransferase ST3Gal-IV on CCL5 receptor interaction was investigated, by using neutrophils and monocytes isolated from ST3Gal-IV deficient and from control mice in functional assays in vitro. The results indicate that the addition of sialic acids to the terminal portions of the N- or O-linked sugar chains of the corresponding receptors of CCL5 is of a minor importance for receptor binding and activation, since the cells similarly mobilize calcium upon stimulation with CCL5. Whereas, the adhesion of neutrophils and monocytes from ST3Gal-IV-/- was significant diminished. Taken together the results obtained here rather support the importance of ST3Gal-IV on the generation of functional selectins, which is in line with previous publications.

Fulltext:
PDF