Identifikation und Charakterisierung neuer frühdiagnostischer Biomarker für das rezidivierende Prostatakarzinom

Geisler, Cordelia; Knüchel-Clarke, Ruth

doi:5281

Identifikation und Charakterisierung neuer frühdiagnostischer Biomarker für das rezidivierende Prostatakarzinom = Identification and characterization of novel diagnostic biomarker for recurrent prostate cancer

Geisler, Cordelia (Author)

2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Cordelia Geisler

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2014

UmfangXII, 245 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Knüchel-Clarke, Ruth (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-11-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-52812
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/465398/files/5281.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Pathologie (528001-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Prostatakrebs (Genormte SW) ; Biomarker (Genormte SW) ; Proteomanalyse (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Prostatakarzinom (frei) ; prostate cancer (frei) ; 2D-DIGE (frei) ; zweidimensionale Difference Gel electrophoresis (frei) ; MRM (frei) ; multiple reaction monitoring (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610
rvk: XH 30003

Kurzfassung
Mit 60.000 erkrankten Männern ist das Prostatakarzinom der häufigste Tumor bei Männern in Deutschland. Jedes Jahr versterben über 12.000 Patienten an ihrem Karzinom. Bis heute ist eine Unterscheidung der aggressiven von den klinisch indolenten Prostatakarzinomen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung nicht möglich, da entsprechend geeignete Biomarker nicht für die Routinediagnostik zur Verfügung stehen. Zudem ist der zurzeit zum Screening auf das Prostatakarzinom eingesetzte Biomarker PSA ausgesprochen umstritten. Ziel dieser Studie war es daher, neue Biomarker zur Diagnose und Prognose des humanen Prostatakarzinoms zu identifizieren. Mittels zwei-dimensionaler Difference in Gel Electrophoresis (2D-DIGE) wurden 27 tumorfreie Gewebeproben, 12 Prostatektomieproben von Prostatakarzinompatienten ohne Rezidiv und 11 Prostatektomieproben von Patienten mit Rezidiv analysiert. Zwischen den Patientengruppen deregulierte Proteinspots wurden mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert. Hierbei konnten 3 Proteine als heraufreguliert und 11 Proteine als herabreguliert in Prostatakarzinomen im Vergleich zum tumorfreien Gewebe identifiziert werden. Zusätzlichen konnten 15 in Prostatakarzinomen mit Rezidiv herauf- und 16 herabregulierte Proteine im Vergleich zu Karzinomen ohne Rezidiv identifiziert werden. Principal Component Analysen ließen eine Trennung von Tumoren mit Rezidiv von jenen ohne Rezidiv zu. Ingenuity Pathway Analysen (IPA) zeigten, dass zwischen Tumoren und tumorfreien Geweben deregulierte Proteine vor allem mit zellulärer Assemblierung und zellulärem compromise assoziiert sind. Im Gegensatz dazu sind im rezidivierenden Prostatakarzinom deregulierte Proteine vor allem mit zellulärer Bewegung (Invasion und Migration), zellulärem Wachstum und Proliferation assoziiert. Beide Gruppen deregulierter Proteine sind außerdem mit zellulärer Entwicklung, zellulärer Morphologie und dem Kohlenhydratmetabolismus assoziiert. In nachfolgenden Validierungsstudien konnte für Annexin A5 sowohl im Western Blot (p=0,041) als auch im Urin mittels Flüssigchromatographie (liquid chromatography)-Multiple Reaction Monitoring-MS (LC MRM MS) eine Heraufregulation in Prostatakarzinomen im Vergleich zu tumorfreien Geweben gezeigt werden. Secernin-1 konnte mittels Western Blot (p=0,001), Immunhistochemie (p<0,001) und Tissue Microarray (TMA) Analysen (p<0,001) als herabreguliert in Prostatakarzinomen im Vergleich zu tumorfreiem Gewebe validiert werden. TMA Analysen von Vinculin hingegen zeigten, dass Vinculin in Prostatakarzinomen heraufreguliert ist im Vergleich zu tumorfreiem Gewebe (p<0,001). Mehr noch konnte im Urin von Prostatakarzinompatienten mit Rezidiv im Vergleich zu Patienten ohne Rezidiv mittels Western Blot (p=0,0229) und LC-MRM-MS (p>0,05) eine Heraufregulation von Vinculin nachgewiesen werden. Damit sind Secernin-1 und Vinculin potentielle neue Biomarker für die Diagnose bzw. Prognose des humanen Prostatakarzinoms. Für TTC38 konnte die Heraufregulation in Tumoren im Vergleich zu tumorfreiem Gewebe mittels Western Blot (p=0,021), Real-time PCR, Immunhistochemie (p=0,009) und TMA Analysen (p<0,001) bestätigt werden. Mehr noch war TTC38 in sämtlichen Analysen mit Ausnahme der TMA Analysen in Karzinomen ohne Rezidiv erhöht im Vergleich zu Karzinomen mit Rezidiv (Western Blot p=0,029, Real-time PCR p=0,030, Immunhistochemie p=0,910). Diese Ergebnisse waren auch im Urin der Prostatakarzinompatienten mittels LC-MRM-MS nachweisbar (p=0,034). Da es sich damit bei TTC38 um einen vielversprechenden Biomarker für das rezidivierende Prostatakarzinom handelt, wurden funktionelle in vitro Analysen durchgeführt. In Kolonienbildungsassays zeigten Klone mit einer hohen TTC38 Expression dabei eine Tendenz zum schnelleren Wachstum und einer höheren Kolonienbildungsfähigkeit. In Migrations- und Invasionsassays zeigten PC-3 TTC38 knockdown Klone eine höhere Migrations- und Invasionsfähigkeit als die zugehörigen Kontrollklone. Allerdings zeigten auch PC3 TTC38 Überexpressionsklone eine höhere Migrationsfähigkeit als die jeweiligen zugehörigen Kontrollklone. LC-MS Analysen der PC-3 TTC38 knockdown und Überexpressionsklone zeigten, dass häufig Proteine der Genexpression zu den mit TTC38 koregulierten Proteinen zählten. In einem letzten Schritt konnte mittels LC-MRM-MS nachgewiesen werden, dass PAP im Urin von Prostatakarzinompatienten signifikant heraufreguliert ist im Vergleich zum Urin von Kontrollpatienten. Zusätzlich war Galectin-3 im Urin von Prostatakarzinompatienten herabreguliert im Vergleich zum Urin von Patienten ohne Rezidiv. Damit konnten unter anderem Vinculin, Galectin-3 und PAP Abundanzen im Urin erfolgreich mittels LC-MRM-MS nachgewiesen werden, was diese Proteine zu vielversprechenden nicht-invasiven Biomarkern für das (rezidivierende) Prostatakarzinom macht.

With more than 60.000 men diagnosed with prostate cancer every year, prostate cancer is the most frequent cancer in men in Germany. More than 12.000 men die due to this carcinoma. Until today, discriminating prostate cancer patients with aggressive cancer from those with indolent cancer is not possible because appropriate biomarkers are not available. Moreover, biomarkers for non-invasive prostate cancer diagnosis are needed, since the widely used biomarker PSA is discussed controversial. Therefore goal of this study was to identify new biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. Using two-dimensional Difference in Gel Electrophoresis (2D-DIGE), 27 tumor free tissue samples, 12 prostatectomy samples from prostate cancer patients without relapse and 11 prostatectomy samples from patients with relapse were analysed. Deregulated proteins were identified using mass spectrometry. Three proteins were up regulated and 11 proteins were down regulated in tumor samples compared to tumor free tissue samples. Additionally, 15 proteins were up regulated and 16 proteins were down regulated in prostate cancer with relapse compared to prostate cancer samples from patients without relapse. Discrimination of samples from prostate cancer patients with and without relapse was possible by using principal component analysis. Ingenuity pathway analysis (IPA) showed that proteins deregulated between tumor and tumor free tissue samples are associated with cellular assembling and cellular compromise, while proteins deregulated between prostate cancer samples with and without relapse are mostly associated with movement (invasion and migration), cellular growth and proliferation. Both groups of deregulated proteins are associated with cellular development, cellular morphology and carbohydrate metabolim. In further analyses, selected proteins were validated. Up regulation of annexin A5 was shown in tissue samples of prostate cancer patients compared to tumor free samples using western blots (p=0,041) and in urine of prostate cancer patients compared to control patients by using liquid chromatography-multiple reaction monitoring-MS (LC-MRM-MS) (p<0,05). Secernin-1 was validated as down regulated in tumor free tissue samples compared to tumor tissue by using Western blots (p=0,001), immunohistochemistry (p<0,001) and independent tissue microarrays (TMA) (p<0,001). TMA analysis of vinculin revealed vinculin as up regulated in prostate cancer compared to tumor free tissue samples (p<0,001). Moreover, this up regulation was shown in urine of prostate cancer patients with relapse compared to those of patients without relapse by using western blot (p=0,229) and LC-MRM-MS (p>0,05). Thus, secernin-1 and vinculin are promising new biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis, respectively. TTC38 is also an interesting prognostic biomarker, as its up regulation in prostate cancer tissue compared to tumor free tissue was validated by using western blots (p=0,021), real-time PCR, immunohistochemistry (p=0,009) and an independent TMA (p<0,001). Moreover, all of these analyses (expect TMA analysis) showed a down regulation of TTC38 in recurrent prostate cancer patients tissue compared to prostate cancer tissue of patients without recurrence (western blots p=0,029, real-time PCR p=030, immunohistochemistry p=0,910). These results were also validated in urine of prostate cancer patients by using LC-MRM-MS (p=0,034). As TTC38 turned out to be a promising and interesting biomarker for prostate cancer prognosis, functional in vitro analyses were done. In colony formation assays, PC-3 clones with higher TTC38 expressions showed a tendency for faster growing and higher colony formation. Migration and invasion assays showed that PC-3 TTC38 knockdown clones showed higher migration and invasion capacity than the control clones. However, even PC-3 TTC38 over expressing clones showed higher migration and invasion capacity than the control clones. Thus, deregulation of TTC38 might influence the migration and invasion capacity of PC-3 cells. Liquid-chromatography mass spectrometry (LC-MS) analyses of PC-3 TTC38 knockdown and over expressing clones showed that proteins of gene expression regulation were co-regulated with TTC38. Finally, PAP was validated as a potential non-invasive biomarker for prostate cancer as LC-MRM-MS analyses revealed PAP as up regulated in urine of prostate cancer patients compared to control urine. Additionally, galectin-3 was down regulated in urine of prostate cancer patients with relapse compared to urine of patients without relapse. Thus, abundances of vinculin, galectin-3 and PAP were successfully determined in urine by using LC-MRM-MS, which turns these proteins into promising biomarkers for (recurrent) prostate cancer.

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