Expression, purification, and crystallization of bacteriorhodopsin and its derivatives

Bratanov, Dmitry; Büldt, Georg; Gordeliy, Valentin

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-038758

Expression, purification, and crystallization of bacteriorhodopsin and its derivatives = Expression, Aufreinigung und Kristallisation von Bacteriorhodopsin und seine Derivate

Bratanov, Dmitry

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Dmitry Bratanov

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Umfang109 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Genehmigende Fakultät
Fak05

Hauptberichter/Gutachter
Gordeliy, Valentin (Thesis advisor) ; Büldt, Georg (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-09-24

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-038758
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/480785/files/480785.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/480785/files/480785.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Geowissenschaften (frei) ; bacteriorhodopsin (frei) ; membrane protein (frei) ; expression (frei) ; crystallization (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 550

Kurzfassung
Die Energieproduktion in lebenden Zellen ist eine der wichtigsten Fragen der modernen Biotechnologie. Bacteriorhodopsin (bR) als eines der einfachsten Mittel zur Erzeugung eines elektrischen Potenzials an einer Membran hat in diesem Zusammenhang große Beachtung gefunden. Auch aufgrund seines häufigen Vorkommens in der Natur in H. salinarum und der relativ unproblematischen Aufreinigung gilt es heute als Modellmembranprotein. Dank seines einzigartigen Photozyklus ist bR ein nützliches, vielversprechendes Protein für eine große Bandbreite technischer Anwendungen, was zu einem steigenden Bedarf geführt hat. Obwohl die Struktur des Proteins aufgeklärt ist, sind Details des Protonenpumpmechanismus von bR noch immer umstritten. Die homologe Produktion von bR und seiner Varianten in Halobakterien ist arbeitsaufwändig, langwierig und ressourcenintensiv. Ein einfaches und robustes E.-coli-Expressionssystem würde daher auf großes Interesse stoßen. In der letzten Zeit wurden verschiedene GPCR-Strukturen mit Hilfe von GPCR-Lysozym-Fusionsproteinen mit Lysozym als Kristallisations-Tag hergestellt. Es ist anzunehmen, dass bR ein geeignetes Modell für die Untersuchung der Verwendungsmöglichkeiten von Lysozym als Kristallisations-Tag sein kann. In meso gewachsene bR-Kristalle neigen zur Zwillingsbildung. Durch Kristallisation des bR-Lysozym-Fusionsproteins können zwillingsfreie Kristalle gewonnen werden, um die Details des Photozyklus von bR näher zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde die Vermutung aufgestellt, dass die geringe Ausbeute bei der bR-Expression in E. coli auf den unzureichenden Einbau des Proteins in die Membran zurückzuführen ist. Es wurde ein Ansatz mit komplementären Proteinen eingeführt, um das Problem bei der Membranproteinexpression mit einer endlichen Anzahl von Schritten zu lokalisieren. Dieser Ansatz basiert auf der Herstellung von Fusionsproteinen, die aus dem untersuchten Protein und einem geeigneten komplementären und homologen Protein bestehen, das mit hoher Ausbeute exprimiert wird. Mithilfe dieses Verfahrens konnte mittels Substitution der ersten zehn Aminosäuren von bR durch die ersten acht Aminosäuren von SRII die Expressionsausbeute von bR um das Fünfzigfache erhöht werden. Grund für die hohe Ausbeute an Fusionsprotein ist möglicherweise, dass das positiv geladene Arg7 am N-Terminus von bR (eine Abweichung von der ‚Innen-positiv-Regel‘) in diesem Protein nicht vorliegt. Es wurden die bR-Varianten R7Q und R7E exprimiert, bei denen die positive Ladung jeweils durch eine neutrale bzw. negative Ladung ersetzt wurde. Obwohl die Ausbeute beider Varianten die des Wildtyps überstieg, lag sie doch deutlich niedriger als bei dem Fusionsprotein. Die positive Ladung am N-Terminus von bR ist daher nicht der Grund für seine schwache Expression in E. coli. Eine vermeintliche Stielstruktur am 5'-Ende der bR-mRNA wurde als weiterer möglicher Grund für die niedrige bR-Expression in E. coli vermutet. Die Expressionsausbeute lag bei dem optimierten bR-Wildtypgen auf dem gleichen Niveau wie bei dem Fusionsprotein. Die geringe Ausbeute bei dem natürlich vorkommenden Bacteriorhodopsin-Gen in E. coli wurde auf seine ungünstige mRNA-Struktur im Bereich der Ribosom-Bindungsstelle zurückgeführt. Bei der Aufreinigung unter nicht denaturierenden Bedingungen bleibt die Funktionalität des Proteins erhalten. Die Ausbeute an funktional homogenem Protein lag bei 2,4 ± 1,3 mg pro Liter Kultur, was für eine Kristallisation im Großmaßstab und industrielle Nutzung ausreichend ist. Mit diesem Ansatz konnten innerhalb kurzer Zeit funktionelle V49A-, D85N- und D96N-Varianten von bR mit einer Ausbeute von 0,3 mg, 3,8 mg bzw. 8,8 mg pro Liter Kultur hergestellt werden. Es ist anzunehmen, dass die erhöhte Ausbeute der D85N- und D96N-Varianten durch einen erfolgreicheren Einbau der positiv geladenen C-Helix von bR in die E.-coli-Membran zurückzuführen ist. Das zweite Ziel, die Kristallisation des bR-Lysozym-Fusionsproteins, erfordert ein hochproduktives Expressionssystem und effektive Kristallisationsansätze. Hier kann bR als Referenz dienen. Hochauflösende Strukturanalysen zeigen, dass bR-Trimere von einem Gürtel aus nativen Lipiden umgeben sind. Obwohl eine Reihe von Expressionsprotokollen für E. coli vorliegen, wurde bisher nicht von einer 3-D-Kristallisation dieses Proteins berichtet. Da das bR-Lysozym-Fusionsprotein bei einer Expression in E. coli keine H.-salinarum-Lipide binden würde und bei der Aufreinigung dieses Proteins DDM statt des üblichen OGs verwendet würde, muss hier sorgfältig untersucht werden, wie sich eine eine solche Lipid/Detergens-Umgebung auf die In-meso-Kristallisation auswirkt. Um den Einfluss des Detergens auf die In-meso-Kristallisation zu untersuchen, wurden großangelegte Kristallisationsversuche mit homolog exprimiertem bR in Detergenziengemischen durchgeführt. Ergebnis waren Kristalle verschiedener Größe (bis zu 300 μm). Bei drei in Gemischen von Detergenzien gewachsenen Kristallen wurde bei der Beugungsanalyse im Synchrotron eine Auflösung von bis zu 1.45 Å gemessen. Die vollständigen Datensätze wurden gesammelt und die drei bR-Strukturen aufgeklärt. Die Elektronendichten, die diesen Strukturen entsprechen, zeigen keine Detergenzienmoleküle. Diese Versuche belegen, dass die Detergenzienmoleküle bei der Entstehung des bR-Kristallgitters keine Rolle spielen. Darüber hinaus besteht keine Notwendigkeit, das für die Aufreinigung verwendete Detergens DDM durch OG zu ersetzen, das im Allgemeinen für die In-meso-Kristallisation von homolog exprimiertem bR verwendet wird. Im Anschluss wurden Kristalle des bR-Wildtyps und der Varianten D85N und D96N unter Verwendung des in E. coli exprimierten Proteins gezüchtet. Die Untersuchung der Beugung mit Synchrotronstrahlung zeigte eine Auflösung von bis zu 2.5Å. Die ersten 3-D-Kristalle des in E. coli exprimierten bR belegen, dass die Expression von bR und seinen Varianten in E. coli für wissenschaftliche und industrielle Anwendungen geeignet ist. Darüber hinaus zeigt die erfolgreiche Kristallisation von aus E. coli isoliertem Protein, dass H.-salinarum-Lipide für das Wachstum regelmäßiger Kristalle nicht unbedingt erforderlich sind. Mit dem optimierten bR-Gen konnten die bR-Lysozym-Fusionsproteine in E. coli mit einer Ausbeute von bis zu 0,9 mg funktionellem Protein pro Liter Kultur exprimiert werden. Dieses Protein wurde unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zur Homogenität aufgereinigt. Die In-meso-Kristallisationsversuche laufen derzeit noch.

Energy production in a living cells is among the most important questions in biology and for the modern technology. Bacteriorhodopsin (bR) being a simplest tool to produce electric potential across membrane have received a lot of attention. It became one of the model membrane proteins, also because of its relative abundance in nature and relative ease of purification from natural source, H. salinarum. Unique properties of bR photocycle make it useful and promising in a wide variety of technical applications, thus giving rise to growing need of this protein. Despite the availability of the atomic structures there are still controversies in mechanism of proton pumping by bR. Homologous production of bR and its mutants in halobacteria is laborious, time-, and resource-consuming, therefore facile and robust E. coli expression system would be of wide interest. Recently several structures of GPCRs were obtained using GPCR-lysozyme fusion protein where lysozyme served as a crystallization tag. We suppose that bR would be a good model for investigation of versatility of lysozyme as crystallization tags. As in meso grown crystals of bR are prone to twinning crystallization of bR-lysozyme fusion protein could provide twinning-free crystals allowing to clarify the details of bR photocycle. In this work, it was suggested that the low yield of bR expression in E. coli can be attributed to the poor insertion of the protein into membrane. We have introduced protein complementary approach that may allow to localize the problem in membrane protein expression using finite number of steps. It is based on constructing of chimeric proteins between a protein of interest and complementary homologous protein expressed with high yield. Applying this approach we showed that the substitution of first ten amino acids of bR for the corresponding eight amino acids from SRII increase the expression yield of bR more than 50-fold. The reason for high yield of the chimera could be the positively charged Arg7 on the N-terminus of bR that deviates from “positive inside” rule and absent in the chimera. We expressed bR mutants R7Q and R7E where this positive charge was substituted for neutral and negative charges, respectively. Although the yields of the mutants were higher than of wild type gene, they were still considerably lower than yield of chimera. Thus, the positive charge on the N-terminus of bR is not the reason of its poor expression in E. coli. A putative stem structure 5'-end of bR mRNA was proposed to be another reason of low bR expression in E. coli. The expression yield of optimized wild type bR gene was on the same level as yield of the chimera. Therefore, the low yield of bacteriorhodopsin native gene in E. coli was attributed to the unfavorable mRNA structure of native gene close to the ribosome binding site. When purified under non-denaturing conditions, the protein have retained its functionality. The yield of functional homogenious protein was 2.4±1.3 mg per liter of culture what is sufficient for a large-scale crystallization and industrial use. Using this approach we produced as well functional V49A, D85N, and D96N mutants of bR in short time with yields of 0.3, 3.8, and 8.8 mg per liter of culture, respectively. We suppose that increased yield of D85N and D96N mutants can be explained by better incorporation of positively charged C-helix of bR into E. coli membrane. The second goal, crystallization of the bR-lysozyme fusion protein, demands a high yield expression system and effective crystallization approaches. Here, bR can serve as a reference. High resolution structures show that bR trimers are surrounded by the belt of native lipid. Despite multiple protocols of E. coli expression, 3D crystallization of this protein was not reported. Since expressed in E. coli bR-lysozyme fusion protein would not have H. salinarum lipids bound and purification of this protein is based on the application of DDM instead of usual OG, careful investigation of the influence of lipid/detergent environment on in meso crystallization is important. To study the influence of detergent on the in meso crystallization we set large-scale crystallization trials with homologously expressed bR in mixtures of detergents. The crystals of different size (up to 300 μm) were obtained. Three crystals grown in mixtures of detergents radiation gave at synchrotron a diffraction up to 1.45 Å. The full datasets were collected and three structures of bR were solved. We have not observed detergent molecules on the electron densities corresponding to the structures. These experiments showed that detergent molecules do not participate in the formation of the crystal lattice of bR. Moreover, there is no need to exchange the detergent from DDM used for purification to OG that is generally used for in meso crystallization of homologously expressed bR. Then, using the protein expressed E. coli the crystals of wild type bR and D85N and D96N bR mutants were grown. Crystals were tested under synchrotron radiation and gave a diffraction up to 2.5Å resolution. The first 3D crystals of bR expressed in E. coli demonstrate that expression of bR and its mutants in E. coli is suitable for scientific and industrial applications. In addition, the successful crystallization of protein isolated from E. coli demonstrated that H. salinarum lipids are not strictly required for grow of well ordered bR crystals. Using the optimized bR gene we have expressed bR-lysozyme fusion proteins in E. coli with yield up to 0.9 mg of functional protein per liter of culture. This protein was purified under non-denaturing conditions to homogeneity and in meso crystallization trials are ongoing.

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