Adjuvant methods to identify and type tumor cells in serous effusions

Botelho de Miranda Onofre, Fabiana; Wellmann, Axel

doi:HT015484324

Adjuvant methods to identify and type tumor cells in serous effusions = Adjuvante Methoden zur Identifizierung und Typisierung von Tumor Zellen in serösen Ergüssen

Botelho de Miranda Onofre, Fabiana

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Fabiana Botelho de Miranda Onofre, geb. Botelho de Miranda

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

Umfang72 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Wellmann, Axel (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-02-28

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-22230
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/49978/files/Botelho_de_Miranda_Onofre_Fabiana.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Pathologie (528001-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Erguss (Genormte SW) ; Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (Genormte SW) ; Mesotheliom (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; effusion (frei) ; mesothelioma (frei) ; FISH (frei) ; DNA-ICM (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
HINTERGRUND: Das Maligne Mesotheliom (MM) ist ein seltener Tumor der serösen Häute mit schlechter Prognose. Prädiktive Studien berichteten über einen Anstieg der Inzidenz dieses Tumors in der folgenden Dekade. Eine frühe und präzise zytologische Diagnose des MM in Körperhöhlen-Ergüssen ist für das folgende therapeutische Procedere essentiell und kann invasive Diagnoseverfahren vermeiden helfen. Die Diagnose des MM in Körperhöhlen-Ergüssen stellt eine der klassischen diagnostischen Herausforderungen der Zytopathologie dar, wird aber in Zukunft stark durch die Verwendung von adjuvanten Methoden unterstützt. Die vorliegende Arbeit untersucht den diagnostischen Nutzen der Zytologie, DNA-Bildzytometrie, Immunzytochemie, AgNOR-Analyse und der chromosomalen Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) für die Diagnose des MM in serösen Ergüssen im Vergleich zu metastatischen Karzinosen.MATERIAL UND METHODEN: 33 Körperhöhlenergüsse, die zwischen März 2005 und Mai der 2007 im Institut für Cytopathologie untersucht wurden, wurden zytologisch als positiv oder verdächtig auf das Vorliegen von Zellen, eines MM diagnostiziert. Dies geschah unter adjuvantem Einsatz von DNA-Bildzytometrie, Immunzytochemie und AgNOR-Analyse. Zusätzlich bestimmten wir den diagnostischen Nutzen einer möglichen 9p21 Deletion mittels chromosomalen FISH. Zum Vergleich der diagnostischen Möglichkeiten verschiedene adjuvante Methoden (DNA-Bildzytometrie, Immunzytochemie, AgNOR-Analyse und FISH) zur Identifizierung und Typisierung von Tumor Zellen, haben wir zusätzlich 31 Ergüsse mit metastatischen Zellen und 39 Tumorzell-negative Ergüsse untersucht. Die Diagnosen aller diese Fälle wurden mittels histologischem und/oder klinischem Follow-up validiert.ERGEBNISSE: Die DNA-Bildzytometrie zeigte Aneuploidie bei 71% der MM, bei 100% von metastatischen Karzinomen und nie bei Tumorzell-negativen Ergüssen. 61.3% der MM zeigten ihre größten DNA-Stammlinien innerhalb des Bereiches 1.8c bis 2.2c und/oder 3.6c bis 4.4c, während nur 19.4% der metastatischen Karzinome ihre größte Stammlinie in dieser Region zeigten. Der immunzytochemische Marker Calretinin war positiv bei 100% der MM, bei keiner der metastatischen Karzinome und bei 94.9% der reaktiven Mesothelzell-reichen, Tumorzell-negativen Ergüsse. Der immunzytochemische Marker BerEP4 war positiv bei 15.6% der MM, 87.1% der metastatischen Karzinome und keiner der Tumorzell-negativen Ergüssen. Mittels AgNOR-Analyse zeigten 89.3% der MM und 96.7% der metastatischen Karzinosen >= 2.5 Satelliten und >= 4.5 gesamte AgNORs pro Zellkern. Bei nur einem Patienten mit Tumorzell-negativem Erguss zeigte sich eine erhöhte Anzahl von AgNORs. Homo- und heterozygote Deletionen von 9p21 traten bei 54.5% beziehungsweise 42.4% der MM auf. Unter Verwendung beider Kriterien zeigte sich eine 9p21 Deletion bei 90.9% der MM. Bei Karzinommetastasen wurde eine homozygote 9p21 Deletion in 19.4% und eine heterozygote 9p21 Deletion in 32.3% gefunden. Keiner der Tumorzell-negativen Ergüsse zeigte einen 9p21 Deletion. Mittels Zytomorphologie alleine wurden 81,8% der MM als sicher positiv diagnostiziert, was durch histologisches und/oder klinisches Follow-up bestätigt wurde. Die Hinzunahme der DNA-Bildzytometrie verbesserte die Prävalenz auf 87.9% und die Hinzunahme der AgNOR-Analyse auf 97%. Wenn zusätzlich das Vorliegen einer homo- oder heterozygoten Deletion von 9p21 mittels FISH bestimmt wird, wurde die Prävalenz eines Tumorzell-Nachweises auf 100% gesteigert. Calretinin positive Zellen wurden bei allen MM und bei keinem metastatischen Karzinom, BerEP4 positive Zellen bei 15.6% der MM, bei 87.1% der Karzinommetastasen und bei keinem Tumorzell-negativen Erguss gefunden. Die Kombination Calretinin-positiv und BerEP4-negativ zeigten 84.4% der MM.SCHLUSSFOLGERUNGEN: Es konnte gezeigt werden, dass viele zytologisch nicht eindeutige Verdachtsfälle auf ein MM durch Anwendung der vorgenannten adjuvanten Methoden alleine oder in Kombination gelöst werden können. Diese können an den bereits existierenden zytologischen Routinepräparaten durchgeführt werden. Die in dieser Arbeit verwendeten Diagnosemethoden haben jeweils eigene Vor- oder Nachteile bezüglich der Spezifität, der Sensitivität, des Arbeitsaufwandes sowie der Kosten. Deshalb wird auf der Grundlage der hier vorgelegten Ergebnisse vorgeschlagen, bei Zytodiagnostisch unsicheren Fällen seröser Körperhöhlenergüsse zusätzlich zur Zytologie erst die DNA-Bildzytometrie, die Immunzytochemie und die AgNOR Analyse als adjuvante Methoden zu verwenden. Weiter unklar bleibende Fälle sollten zusätzlich auf das Vorliegen einer 9p21 Deletion mittels FISH untersucht werden. Weitere Untersuchungen mit größeren Patientenzahlen sind erforderlich, um Validität und Effizienz des vorgeschlagenen diagnostischen Vorgehens zur Verbesserung der diagnostischen Sicherheit in der Ergusszytologie zu bestimmen.

BACKGROUND: Malignant mesothelioma (MM) is a rare tumor of the serosal membranes with a poor prognosis. Studies predict an increasing incidence of this tumor in the next decade. An early and precise diagnosis of MMs in effusions is crucial for patient management and may avoid unnecessary invasive procedures. However, this diagnosis represents one of the classic diagnostic challenges of cytopathology in serous effusions. It may be overcome by the application of adjuvant methods. The current study investigated the usefulness of cytology, DNA-image cytometry (DNA-ICM), immunocytochemistry, AgNOR-analysis, and chromosomal fluorescence in situ hybridization (FISH) for the diagnosis of MM and of metastatic carcinoma in serous effusion.MATERIALS AND METHODS: A total of 33 effusions received between March 2005 and May 2007 were cytologically diagnosed as suspicious or positive for MM cells using DNA-ICM, immunocytochemistry and AgNOR-analysis as adjuvant methods. We further investigated the detection of 9p21 deletions by chromosomal FISH. To test the utility of adjuvant methods to identify and type tumor cells in serous effusions, we investigated additionally 31 cases of metastatic carcinomas and 39 of tumor cell-negative effusions containing reactive mesothelial cells only, applying DNA-ICM, immunocytochemistry, AgNOR-analysis and chromosomal FISH. All diagnoses were confirmed by histologic and/or clinical follow up.RESULTS: Using DNA-ICM, aneuploidy was found in 71% of MMs, 100% of metastatic carcinomas and in none of tumor cell-negative effusions. 61.3% of MMs showed their greatest DNA stemline within the range of 1.8c and 2.2c and/or 3.6c and 4.4c, while only 19.4% of metastatic carcinomas showed their greatest stemline in this region. The immunocytochemical marker Calretinin was positive in 100% of MMs, none of metastatic carcinomas and 94.9% of reactive mesothelial cells in tumor cell-negative effusions. BerEP4 showed positivity in 15.6% of MMs, 87.1% of metastatic carcinomas and none of tumor cell-negative effusions. Using AgNOR-analysis, 89.3% of MMs, and 96.7% of metastatic carcinoma showed >= 2.5 AgNOR dots as satellites and >= 4.5 as total AgNOR counts. Only one case of tumor cell-negative effusion revealed an increased number of AgNOR dots. 9p21 homo- and heterozygous deletions were demonstrated in 54.5% and 42.4% of MM cases, respectively. This represents 90.9% of 9p21 deletion, when both criteria are applied. In metastatic carcinomas, the 9p21 homozygous deletion was found in 19.4% and in 32.3% a 9p21 heterozygous deletion. None of the tumor cell-negative effusions demonstrated 9p21 deletions. When cytology alone was used for the diagnosis, 81.8% of MM cases were identified with certainty as tumor cell positive, confirmed by histologic and/or clinical follow-up. The addition of DNA-ICM improved the prevalence of tumor cell detection to 87.9% and the addition of AgNOR-analysis to 97%. The further introduction of FISH as an adjuvant method could improve the prevalence of tumor cell-detection to 100% if 9p21 homo- and heterozygous deletion were used as diagnostic parameters. To differentiate metastatic carcinoma from MM or reactive mesothelial cells, calretinin positivity was found in all cases of MM and in none of metastatic carcinoma; BerEP4 positivity was found in 15.6% of MM, 87.1% of metastatic carcinoma and none of tumor cell- negative effusions. The combination of calretinin positivity and BerEP4 negativity was found in 84.4% of MM cases.CONCLUSION: We have shown that many cases in which cytology on serous effusions is suspicious or doubtful can definitely be solved by one of these adjuvant methods or by their combination and that these may be performed on existing routine cytological smears. The diagnostic methods used in the current study bear individual intrinsic advantages and disadvantages in terms of specificity and sensitivity, laborious effort, and cost effectiveness. Based on our results, we suggest first the parallel application of DNA-ICM, immunocytochemistry, and AgNOR-analysis as adjuvant methods to solve difficult cases of diagnostic cytology in serous effusion. Persistent doubtful diagnoses could be overcome by the application of FISH to analyze the 9p21 deletion. Further studies on larger series of patients are needed to evaluate the validity and efficiency of this approach to improve the diagnostic accuracy of effusion cytology.

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