Applications of two focus fluorescence correlation spectroscopy in colloid and polymer science

Müller, Claus Bernhard; Richtering, Walter

doi:HT015654151

Applications of two focus fluorescence correlation spectroscopy in colloid and polymer science = Anwendungen der Zwei-Fokus-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie in der Kolloid- und Polymerforschung

Müller, Claus Bernhard

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Claus Bernhard Müller

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

Umfang154 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Zusammenfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Richtering, Walter (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-08-22

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-25183
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50239/files/Mueller_Claus.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Spektroskopie (Genormte SW) ; Optische Spektroskopie (Genormte SW) ; Laserinduzierte Fluoreszenz (Genormte SW) ; Fluoreszenz (Genormte SW) ; Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (Genormte SW) ; Mikroskopie (Genormte SW) ; Konfokale Mikroskopie (Genormte SW) ; Kolloidchemie (Genormte SW) ; Kolloidphysik (Genormte SW) ; Polymere (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; Zwei-Fokus (frei) ; Fluoreszenz (frei) ; Korrelationspektroskopie (frei) ; 2fFCS (frei) ; Two focus (frei) ; fluorescence (frei) ; correlation spectroscopy (frei) ; dual focus fluorescence correlation spectroscopy, 2fFCS (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die thermischen Fluktuationen in flüssigen Proben ermöglichen die Berechnung hydrodynamischer Radien (Rh) von beobachteten Teilchen. Dafür ist es notwendig, einen Streukontrast zwischen den zu beobachtenden Teilchen und der umgebenden flüssigen Phase zu erzeugen. In der statischen und dynamischen Lichtstreuung (SLS/DLS) entsteht dieser Kontrast durch die unterschiedlichen Brechungsindizes von Probe und Lösungsmittel, wohingegen bei der Kleinwinkel Neutronenstreuung (SANS) die Kontrastierung im Wesentlichen auf den unterschiedlichen Streulängen von Wasserstoff und Deuterium beruht, wodurch unterschiedliche Teile einer Probe hervorgehoben werden können. Die in der Arbeit präsentierten Ergebnisse wurden mit der neuen Methode zwei-Fokus Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (2fFCS) erhalten, indem 2fFCS auf kolloidale Systeme angewendet wurde. Die Untersuchungen können mit vergleichbarer Präzession wie mit etablierten Methoden durchgeführt werden. 2fFCS ist jedoch unempfindlich gegenüber vielen optischen und photophysikalischen Effekten. Die referenzfreie und absolute Messung von Diffusionskoeffizienten (D) bei Konzentrationen nahe denen einer idealen Lösung wird möglich, indem eine externe Längenskala, zwei überlappende Anregungsfoki mit genau bekanntem Abstand, in das Experiment eingeführt wird. Die Datenbeurteilung im 2fFCS Experiment wird so modifiziert, daß finite Größeneffekte in kolloidalen oder makromolekularen Systemen berücksichtigt werden. Zur Erzielung optimaler Messergebnisse ist es jedoch notwendig einige apparative und experimentelle Faktoren zu berücksichtigen. Dabei spielt die genaue Temperaturkontrolle, wegen der temperaturabhängigen Lösungsmittelviskosität, eine entscheidende Rolle. Die vorgestellte Probenzelle für inverse Mikroskope erlaubt die Temperaturgenauigkeit von +/- 0.05 K im Temperaturbereich von 5 bis 65°C. Ein verstellbares unabhängiges Einstellen des Heiz- und Kühlverhaltens ist möglich und erlaubt den Einsatz der Probenzelle mit Mikroskopen ohne Objektivheizung. Die durchgeführten Diffusionsexperimente in wässrigen Lösungen demonstrieren die exzellente Temperaturstabilität und Reproduzierbarkeit der Probenzelle. Dadurch wird es möglich berührungslose Temperaturmessungen in mikrofluidik Bauteilen genauer durchzuführen. Die bekanntesten Methoden mit einer räumlichen Auflösung von Mikrometern nutzen die temperaturabhängige Fluoreszenzlebenszeit oder die temperaturabhängige Größenänderung thermosensitiver Materialien. Da 2fFCS im Gegensatz zu Standardmethoden unter variierenden Bedingungen eingesetzt werden kann, ergibt sich ein wesentlich breiteres Anwendungsgebiet als bisher. Ein weiterer instrumenteller Faktor und die notwendige Bedingung für eine quantitative Datenauswertung der 2fFCS Experimente, ist die Kenntnis des exakten Scherabstandes, hervorgerufen durch das Nomarski Prisma, welcher durch die extrinsische Längenskala zur Bestimmung von D widergespiegelt wird. Durch die Kombination von FCS und DLS kann der Scherabstandes mit einer Genauigkeit im Bereich von Nanometern bestimmt werden und die hoch präzisen Messungen der Diffusion von Standardreferenz-Fluoreszenzfarbstoffen in nahezu unendlich verdünnter Lösung wird möglich. Es stellt sich im Besonderen heraus, dass D von Rhodamin 6G um 37% größer ist als der Wert, der in den meisten Publikationen genannt wird. Bewegt man sich nicht am Rand der idealen Verdünnung, sondern zur Untersuchungen der molekulare Diffusion in hochkonzentrierten Probenumgebungen, ist es notwendig die Unterschiede zwischen dem Brechungsindex der Probe und dem Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit zu berücksichtigen. Die Theorie der 2fFCS ermöglicht es D absolut und ohne weitere Kalibration zu bestimmen, was durch Untersuchungen an einem literaturbekannten System aus fluoreszenzmarkierten 70 kDa Dextranen in einer nicht markierten 70 kDa Dextran-Matrix bestätigt wird. Als Beispiel für spezielle Moleküldynamik werden in dieser Arbeit qualitative und quantitative Untersuchungen der Layer-by-Layer Anordnungen von Polyelektrolyt-(PE)-Mehrfachschichten auf weichen porösen temperatursensitiven Mikrogelen beschrieben. Da PE's während der Schichtbildung sowohl mit sich selbst als auch mit Mikrogelen wechselwirken, konnte bisher nur unzureichend zwischen PE's auf der Oberfläche und innerhalb des Mikrogels unterschieden werden. Es ist jedoch möglich zwischen freien gelabelten und an die Mikrogele gebundenen PE's zu unterscheiden. Eine zwei-Farben-Korrelation und die Aufnahme von Fluoreszenzbildern bestätigt, dass beide PE's an den gleichen Partikel gebunden sind.

Thermal fluctuations in liquid samples can be used to calculate the hydrodynamic radii (Rh) of observed particles. Therefore, it is necessary to generate scattering contrast between the observed particles and the surrounding liquid phase. In static- and dynamic light scattering (SLS/DLS) experiments this contrast is usually created by the different refractive indices of sample and solvent, whereas in small angle neutron scattering (SANS) the differences in the scattering lengths of hydrogen and deuterium are responsible for the contrast. This thesis presents results obtained on colloidal systems by a new method, dual focus Fluorescence Correlation Spectroscopy (2fFCS), which permits investigations of comparable precision to established methods. 2fFCS is insensitive to many optical and photo-physical effects. An external length scale is introduced into the measurement by creating two overlapping excitation foci at a precisely known distance, thus allowing reference free and absolute measurements of diffusion coefficients (D) close to the infinite dilution limit. 2fFCS data evaluation is modified for taking into account correctly finite size effects in colloidal and macromolecular systems. Nevertheless, it is necessary to consider some instrumental and experimental issues to achieve the best results. The most important instrumental part is precise temperature control of the sample environment, which plays a key role, on account of the strong temperature dependence of the solvent viscosity. The presented sample cell for inverted microscopes has a temperature accuracy of +/- 0.05 K in a temperature range of 5 to 65°C. A tunable independent setting of heating- and cooling behavior is possible and allows the application to microscopes without any objective heating. Diffusion experiments performed in aqueous solutions demonstrate the excellent temperature stability and reproducibility of the device. Due to this, it is possible to carry out remote temperature measurements in microfluidic devices with higher accuracy than before. The most popular methods with micrometer spatial resolution use temperature dependent fluorescence lifetime or temperature dependent size of thermo responsive materials. Because 2fFCS is generally applicable under various conditions the possible field of applications is much broader with comparable or even better accuracy than with common methods. Another instrumental factor and necessary condition for quantitative data evaluation of 2fFCS experiments is exact knowledge of the shear distance induced by the Nomarski DIC prism, which represents the extrinsic length scale for determining D. The presented calibration technique based on a combination of FCS and DLS allows determination of shear distances with nanometer accuracy, and high precision measurements of diffusion of reference standard fluorescence dyes close to the regime of infinite dilution is possible. In particular, it is found that D of the reference dye Rhodamine 6G is by 37% larger than the value used in most publications on FCS! However, many investigations do not deal with systems at the limit of infinite dilution but with molecular diffusion in crowding environments and it is necessary to consider the differences between the local refractive index in a sample and the refractive index of the immersion liquid. The theory of 2fFCS enables the absolute determination of D without additional calibration; this is confirmed by investigations on a well known system of a fluorescently labeled 70 kDa dextrane in an unlabeled 70 kDa dextrane matrix. As an example for a special kind of molecular dynamics qualitative and quantitative investigations on Layer-by-Layer (LbL) assembly of polyelectrolyte (PE) multilayers on soft and porous temperature sensitive microgels are presented in this thesis. As PEs are able to interdigitate with each other during multilayer formation as well as with the microgel it was not posible so far to distinguish between PE adsorbed on or in the microgel. But a clear difference between free labeled PE and those that are bound to the microgel is possible; dual color correlation confirmed the presence of both PE's bound to the same particle, while fluorescence imaging provided the visual proof.

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