Entwicklung und Evaluation von IgY-Antikörpern gegen die Metalloproteinase ADAM12

Schoennagel, Janina; Pufe, Thomas

doi:29052

Entwicklung und Evaluation von IgY-Antikörpern gegen die Metalloproteinase ADAM12 = Development and evaluation of IgY antibodies against the metalloproteinase ADAM12

Schoennagel, Janina (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Janina Schoennagel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

Umfang88 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak10

Hauptberichter/Gutachter
Pufe, Thomas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-01-22

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-27168
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50711/files/Schoennagel_Janina.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Anatomie und Zellbiologie (511001-5)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Adam (Genormte SW) ; Immunglobulin Y (Genormte SW) ; Immunglobulin G (Genormte SW) ; Immunoblot (Genormte SW) ; Immuncytochemie (Genormte SW) ; Gelelektrophorese (Genormte SW) ; Plazenta (Genormte SW) ; Medizin (frei) ; Adam 12 (frei) ; Metalloproteinasen (frei) ; metalloproteinases (frei) ; immunoglobulin G (frei) ; immunoglobulin Y (frei) ; immunoblot (frei) ; immunocytochemistry (frei) ; gel electrophoresis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 610

Kurzfassung
Die Abkürzung ADAM steht für „ A Disintegrin And Metalloproteinase“ und beschreibt eine Gruppe von Glycoproteinen, die zusammen mit den SVMP’s (Snake Venom Metalloproteasen) zur Reprolysin- Familie der Metalloproteasen gehört. Bei ADAM12 handelt es sich um ein Mitglied der ADAM Familie. Die existierenden Splicevarianten ADAM12-S und ADAM12-L haben eine typische Domänenstruktur, bestehend aus einem „signal peptide“, einer „prodomain“, einer „metalloproteinase domain“, einer „disintegrin domain“, einer „cysteine-rich domain“ und im Falle von ADAM12-L einer zusätzlichen „transmembrane domain“ und einem „cytoplasmic tail“. Die Funktion von ADAM12 besteht in der Vermittlung von Zell-Zell Kontakten in Form von Zell-Adhäsion, Zell-Zell Fusion und Zell Invasion. ADAM12 ist eine katalytisch aktive Protease und seine Funktion bei der Vermittlung der Myoblastenfusion, als auch bei der Entstehung der Osteoklasten gilt als bewiesen. ADAM12 wurde in Synzytiotrophoblasten der Plazenta nachgewiesen. Es ist aber fraglich, ob ADAM12 bei der Fusion der Synzytiotrophoblasten eine Rolle spielt. Der Nachweis der Überexpression von ADAM12 in Tumorgeweben (z.B. Mamma-, Harnblasenkarzinom) lässt vermuten, dass ADAM12 im Zusammenhang mit der Tumorzellinvasion steht. Es konnte gezeigt werden, dass die ADAM12 Konzentration mit der Tumorprogression und dem Grading des Tumors korreliert. Der Nachweis von ADAM12 im Serum von schwangern Frauen spricht dafür, dass ADAM12 wichtig für das fetale Wachstum, das Plazentawachstum und den Erhalt der intakten Schwangerschaft ist. Es konnte gezeigt werden, dass bei einer verminderten ADAM12 Serumkonzentration im 1. Trimester gehäuft Chromosomenaberrationen beim Kind (Trisomie 21 und 18) oder eine Präeklampsie bei der Mutter auftraten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von ADAM12 zu einer vermehrten Ausschüttung der Oxytocinase (P-LAP) führt. Eine Verringerung des Oxytocinasespiegels in der Schwangerschaft wird hingegen als Hinweis auf eine Fehlfunktion der Plazenta gewertet. Abschließend ist ADAM12 für die Aktivierung von Wachstumsfaktoren in Form von EGF (Epidermal Growth Factor) und IGFI und II (Insulin like Growth Factor) verantwortlich. Die Überexpression von ADAM12 in Kardiomyozyten führt durch die Aktivierung des EGF zur Entstehung der Hypertrophischen Obstuktiven Kardiomyopathie. IGFI und II sind von großer Bedeutung bei der embryonalen und fetalen Entwicklung. Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, einen spezifischen Antikörper gegen die einzelnen Domänen von ADAM 12 zu entwickeln. Die Anforderungen an diesen Antikörper bestehen in der einfachen und kostengünstigen Herstellung von großen Antikörpermengen sowie in der guten Reproduzierbarkeit des Antikörpers. Hierfür wurden sowohl Hühner, als auch Kaninchen mit den gleichen Immunogenen gegen ADAM12 geimpft. Die IgY bzw. IgG Antikörper wurden im Rahmen von Western Blot Immunreaktionen und immunhistochemischen Versuchen an Plazenta aus dem 1. und 3. Trimester getestet und abschließend verglichen. Im Rahmen der Western Blot Immunreaktion konnten sowohl die IgY Antikörper aus Hühnereigelb, als auch die IgG Antikörper aus Kaninchenserum ihre Spezifität für ADAM12 beweisen. Sie stellten die für ADAM12 typischen Banden bei 92, 68 und 40kDa dar. Die immunhistochemischen Versuche an Plazenta aus dem 1. und 3. Trimester zeigten, dass die Kaninchenserumantikörper sehr gut ADAM12 im Bereich der Synzytiotrophoblasten der Plazentazotten nachweisen. Die IgY Antikörper aus Hühnereigelb hingegen dienten nur dem Nachweis von ADAM12 in Synzytiotrophoblasten der Plazenta aus dem 1. Trimester. Schlussendlich ist ADAM12 aufgrund seiner genannten Eigenschaften in Zukunft von großer klinischer Bedeutung und könnte als möglicher Biomarker zur Diagnostik und Verlaufskontrolle gewisser Erkrankungen von Nutzen sein. Für die Entwicklung und Austestung eines standardisierten Verfahrens zur Detektion von ADAM12 ist die kostengünstige Herstellung großer Mengen eines spezifischen, reproduzierbaren Antikörpers gegen ADAM12 notwendig. Die IgY Antikörper aus Hühnereigelb bieten hierbei einige Vorteile gegenüber den IgG Antikörpern aus Kaninchenserum. Sie sind in ihrer Herstellung viel kostengünstiger und Ihre Gewinnung erfolgt unblutig und ist nicht invasiv. Zudem ist der Antiköperertrag aus einem Huhn in einem Jahr ca. 30fach höher im Vergleich zu der Antikörpermenge aus dem gesamten Serum eines Kaninchens. Da die Hühner in ihrer Abstammung weit von den Säugetieren entfernt sind, ist mit einer stärkeren Immunreaktion zu rechen. Weiterhin zeigen die IgY Antikörper aus Hühnereigelb keine Kreuzreaktivität mit humanen Rheumafaktoren. Der Nachteil kommerziell erhältlicher IgG Antikörper aus Kaninchenserum besteht darin, dass die Chargen irgendwann vergriffen sind und neue Klone eine modifizierte Antikörperqualität aufweisen. Die eigene Herstellung von IgY Antikörpern aus Hühnereigelb stellt demzufolge eine kostengünstige und gut realisierbare Alternative dar.

The abbreviation ADAM means „A Disintegrin And Metalloproteinase” and describes a group of glycoproteins, which are together with the SVMP’s (Snake Venom Metalloproteases) part of the reprolysin family of metalloproteases. ADAM12 is a part of the ADAM family. The two existing splice forms ADAM12-S and ADAM12-L are composed of a typical domain structure, which is a “signal peptide”, a “prodomain”, a “metalloproteinase domain”, a “disintegrin domain”, a “cysteine-rich domain” and in case of ADAM12-L a additional “transmembrane domain” and a “cytoplasmic tail”. ADAM12 mainly functions as a mediator of cell to cell contact, such as cell adhaesion, cell cell fusion and cell invasion. ADAM12 is a catalytically active protease and has a proven role during myoblast fusion and in the formation of osteoclasts. ADAM12 has also been found in syncytiotrophoblasts of placenta, even though its function during fusion of syncytiotrophoblasts has not been proven yet. The proven overexpression of ADAM12 in human cancer tissues, such breast and bladder cancer, leads to the presumption, that ADAM12 is connected to tumor cell invasion. Here the ADAM12 concentration also correlates with the tumor progression and the tumor grading. ADAM12 has also been detected in serum of pregnant women, which leads to the presumption, that ADAM12 has an important role for fetal growth, growth of the placenta and the preservation of pregnancy. It has been shown, that a low ADAM12 concentration in the serum of pregnant women in the first trimester correlates with the development of Trisomie 18 and 21 in the children and preaclampsia in the pregnant women. It has also been shown, that the overexpression of ADAM12 mediates shedding of the Oxytocinase (P-LAP). A low Oxytocinase level in pregnancy is an indication for a disfunctional placenta. Finally ADAM12 is responsible for the activation of growth factors such as EGF (epidermal growth factor), IGF I and II (insulin like growth factor). The overexpression of ADAM12 in cardiomyocytes leads to the activation of EGF resulting in the development of HOCM (hypertrophic obstructive cardiomyopathia). IGF I and II are of main importance during embryonal and fetal development. The aim of this work is to produce a specific polyclonal antibody against the different domains of ADAM12. The production of this antibody requires to be cheap and easy on the one hand and on the other hand the amount of produced antibody is supposed to be big. Also the antibody needs to be reproducible. Therefore hens as well as rabbits have been immunized with the same immunogen against ADAM12. The resulting IgY and IgG antibodies were tested in western blot immunoreactions and immunohistochemical staining on placenta of the first and the third trimester. In the end the results have been compared. As well the IgY antibodies out of egg yolk as the IgG antibodies out of rabbit sera proved their specificy for ADAM12 in the western blot immunoreaction. They were able to show the typical ADAM12 lines at 92, 68 and 40 kDa. The immunohistochemical staining of slices of first trimester and term placenta showed, that IgG antibodies out of rabbit sera served very well for the detection of ADAM12 in the syncytiotrophoblasts of placenta villous. Instead the IgY antibodies out of egg yolk are only able to prove the existence of ADAM12 in the syncytiotrophoblast villous of first trimester placenta. In the future ADAM12 will be of high clinical significance and can serve as a possible marker for diagnostic and progress of certain diseases. For the development of a standardized test for the detection of ADAM12 we need a cheap production of high amounts of ADAM12 specific and reproducible antibodies. The IgY antibodies out of egg yolk offer a few advantages towards the IgG antibodies out of rabbit sera. The IgY antibodies are much cheaper in their production and their extraction is unbloody and non invasive. Furthermore the amount of antibody out of one hen during a whole year is about thirty times higher than the amount of antibody out of the whole serum of one rabbit. It is a matter of fact that hens are distant from mammals in their origin, which results in a stronger immunoreaction. Also the IgY antibodies don’t show any cross reactivity towards human rheumatic factors. That leads to less wrong positive results in serum testings. The disadvantage of commercially purchased IgG antibodies out of rabbit sera is that at some point of time their charge is not available anymore and the new clones will be of a modified antibody specificy. In conclusion the development and production of IgY antibodies out of egg yolk is a cheap and realistic alternative.

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