Biophysikalische Charakterisierung und biochemische Steuerung von Methyltransferase-DNA-Wechselwirkungen

Bahr, Matthias; Weinhold, Elmar

doi:HT016121732

Biophysikalische Charakterisierung und biochemische Steuerung von Methyltransferase-DNA-Wechselwirkungen = Biophysical characterisation and biochemical direction of methyltransferase-DNA-interactions

Bahr, Matthias

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Matthias Bahr

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangVIII, 192 Bl. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Weinhold, Elmar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-05-28

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-29267
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51319/files/Bahr_Matthias.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
DNS-Methyltransferase (Genormte SW) ; DNS (Genormte SW) ; Enzym (Genormte SW) ; Biochemische Analyse (Genormte SW) ; Fluoreszenzspektroskopie (Genormte SW) ; Chemie (frei) ; Biophysikalische Analyse (frei) ; DNA (frei) ; enzyme (frei) ; DNA-methyltransferase (frei) ; fluorescence spectroscopy (frei) ; bioanalytics (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von biophysikalischen Methoden die Wechselwirkung von DNA-Methyltransferasen (MTasen), insbesondere von M.TaqI, mit DNA charakterisiert und mittels biochemischer Ansätze systematisch gesteuert. So konnte am Beispiel von M.TaqI die Leistungsfähigkeit von stopped flow-Messungen mit Beobachtung der UV-Absorption zur kinetischen Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen demonstriert werden. Die bei UV-Detektion oftmals problematische Zuordnung von bestimmten konformationellen Änderungen zu den gemessenen Phasen war in diesem Fall, aufgrund der guten Übereinstimmung mit fluoreszenzspektroskopischen Experimenten aus vorherigen Studien, möglich. Die hier gezeigten Experimente haben den Vorteil, dass sie keine aufwendige Fluoreszenzmarkierung der Substrate erfordern, Messungen am natürlichen System erlauben und bislang unentdeckte enzymatische Schritte detektieren können. In einem anderen Projekt wurden fluoreszenzmarkierte Duplex-ODN mit unterschiedlichem Design biophysikalisch charakterisiert und auf ihre Eignung zur Detektion der M.TaqI-DNA-Wechselwirkung mittels Fluoreszenzanisotropie geprüft. Dabei stellte sich heraus, dass ein Duplex-ODN mit erzwungener Intercalation der Fluoreszenzsonde die besten Ergebnisse liefert. Es zeigt die größte Fluoreszenzanisotropieänderung von den untersuchten Systemen und nur eine minimale Fluoreszenzintensitätsänderung bei der Enzymbindung. Topologien mit einer relativ frei beweglichen Fluoreszenzsonde am 5’-Ende des Duplex-ODN führen hingegen zu unerwünschten Wechselwirkungen mit dem Enzym oder einer zu geringen Fluoreszenzanisotropieänderung. Mit Hilfe eines Ethidiumbromid-markierten Duplex-ODN konnte erstmals eine zuverlässige Methode zur Bestimmung der DNA-M.TaqI-Dissoziationskonstante entwickelt werden. Für die Bindung von M.TaqI an die natürliche Erkennungssequenz beträgt die Dissoziationskonstante Kd = 0.34 nM. Unter anderem aufgrund der hohen Stabilität dieses Komplexes führten bisherige Studien mit 2Ap-markierten Duplex-ODN zu stark unterschiedlichen Ergebnissen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe von biochemischen Methoden die MTase-DNA-Wechselwirkung systematisch gesteuert. Dazu wurde beispielsweise anstelle des natürlichen Cofaktors AdoMet das Aziridin-Cofaktoranalogon Az eingesetzt. Im Gegensatz zu AdoMet wird bei Az der gesamte Cofaktor kovalent mit der Substrat-DNA gekuppelt. Auf diese Weise entstehen Bisubstratanaloga, deren Komplexe mit M.TaqI und M.HhaI eine 5000mal bis 10000mal langsamere Dissoziationsgeschwindigkeit aufweisen als der betreffende Komplex mit dem natürlichen Methylierungsprodukt. Auch die thermodynamischen Dissoziationskonstanten liegen mehrere Größenordnungen unter denen der natürlichen Produktkomplexe, so dass diese Verbindungen aussichtsreiche Kandidaten für DNA-MTase-Inhibitoren darstellen. Durch den Einbau von hydrophoben Basensurrogaten an die Position des Zielbasenpartners lässt sich die Bindungsaffinität von M.TaqI an DNA systematisch um bis zu drei Größenordnungen erhöhen. Für eine Vielzahl von Basensurrogaten konnten die betreffenden Dissoziationskonstanten mittels kompetitiver Fluoreszenztitrationen mit einem Pyren-markierten Duplex-ODN bestimmt werden. Die Verbindungen könnten für DNA-bindende Enzyme zur Analyse des Bindungsmechanismus verwendet werden oder in Studien über pi Stapelwechselwirkungen diesen noch immer schlecht verstandenen Effekt näher beleuchten. Macrocyclische Bisintercalatoren bieten eine Möglichkeit, die Bindung von M.TaqI und vermutlich auch von Reparaturenzymen an fehlgepaarte DNA zu hemmen. Dies konnte in einem kompetitiven fluoreszenzspektroskopischen Bindungsassay mit einem 2Ap-markierten Duplex-ODN gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Eigenschaften von mehreren Vertretern dieser Verbindungsklasse charakterisiert. Dabei stimmten die Ergebnisse aus unabhängigen biophysikalischen Methoden gut überein und lassen vermuten, dass diese Moleküle prinzipiell auch die wichtige Detektion von Punktmutationen im Genom ermöglichen können. Dazu müsste allerdings noch die Markierung dieser Moleküle mit einer robusten Reportergruppe erfolgen. Ein weiterer Weg, um die Wechselwirkung von MTasen mit DNA zu steuern, ist die kovalente Verknüpfung mit einem Triplehelix-bildenden Oligodesoxynucleotid (TFO). Diese Modifikation wurde in vorherigen Arbeiten erfolgreich durchgeführt und das MTase-TFO-Konjugat zeigt gegenüber dem freien Enzym eine drastisch erhöhte Sequenzspezifität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sensitives fluoreszenz-spektroskopisches Verfahren entwickelt, mit dem die Bindung des TFO an das Duplex-ODN charakterisiert werden kann. Mit Hilfe der Methode lässt sich z.B. die Bindung des TFO an Plasmid-DNA in Echtzeit verfolgen oder die Dissoziationskonstante der Triplehelix abschätzen. Dafür wurden in beiden Fällen Messungen bei extrem geringen Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich durchgeführt.

This work explores the use of biophysical methods for the characterisation of DNA methyltransferase (MTase) interactions with DNA and their methodical direction by means of biochemical approaches. Taking the MTase M.TaqI as a paradigm, the kinetic analysis of these interactions is performed by stopped flow measurements with detection of the UV absorption. Compared to the more elaborate monitoring of synthetic fluorescent labels this method enables the investigation of the unmodified natural system. Due to the numerous chromophores it may also allow the detection of hitherto unknown kinetic steps, which is highlighted in the present work. Another project deals with diverse strategies for the fluourescent labelling of short duplex-DNA with regard to the analysis of M.TaqI-DNA-interactions using fluorescence anisotropy. In this study, a topology with forced intercalation of the fluorescent probe emerged as the most suited alternative. It shows a huge fluorescence anisotropy increase and no significant fluorescence intensity change upon M.TaqI binding. An analogously probed duplex-DNA was taken to determine a reliable dissociation constant for the M.TaqI-DNA complex which was found to be Kd = 0.34 nM. Because of the great complex stability, former studies with 2 aminopurine labeled DNA led to rather diverse parameters. In contrast to forced intercalation of the fluorescent probe, topologies with a rather mobile fluorescent probe at the 5’-end of the duplex-DNA turned out to be prone to unwanted interactions with the enzyme or to a marginal fluorescence anisotropy increase. The second part of this work consists of four approaches to biochemically direct the MTase-DNA interaction in different ways. One strategy was to take advantage of the known aziridine cofactor analogue Az which is covalently coupled to the target DNA by several MTases. The formed complexes represent bisubstrate analogues and are extremely stable. In the case of M.TaqI and M.HhaI their dissociation rates are 5,000 to 10,000 times slower than the MTase complexes with the natural methylation products. Accordingly, their thermodynamic dissociation constants are also several magnitudes lower than those of the natural product complexes which render these bisubstrate analogues to be promising candidates for DNA-MTase inhibitors. The replacement of the natural target base partner in the M.TaqI recognition sequence by hydrophobic base surrogates also led to a dramatic increase in the DNA binding affinity of M.TaqI of up to three magnitudes. The dissociation constants of multiple compounds were measured by the use of a competitive binding assay with pyrene-labelled duplex-DNA. The gathered data give insight into  stacking interactions in enzyme-DNA complexes and can be utilized for the investigation of DNA binding mechanisms of other enzymes. In a competitive fluorescence binding assay with 2-aminopurine-labelled DNA, it was demonstrated that distance-constrained macrocyclic bisintercalators represent a tool to biochemically influence the binding of M.TaqI and presumably of repair enzymes to mismatched DNA. In addition, the mismatch binding specificities of several bisintercalators were characterised in good agreement by several independent bioanalytical methods. These results suggest that the crucial detection of point mutations within the genome can be achieved with this sort of molecules, but it would make the conjugation of the bisintercalators to robust reporting groups, e.g. fluorophors, necessary. In the last chapter, the DNA-binding properties of an MTase which is covalently linked to a triplehelix-forming oligonucleotide (TFO) were investigated. This conjugate has been synthesised in previous works and exhibits dramatically increased sequence specificity compared to the unmodified MTase. A very sensitive and straightforward fluorescence assay was developed within the scope of the present work that enables the observation of the conjugated TFO binding to duplex-DNA. The assay allows for measurements at low nanomolar concentrations, e.g. real-time monitoring of the TFO binding to plasmid-DNA or the estimation of the dissociation constant of the formed triplehelix.

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