Requirements for cleavage and function of the transmembrane chemokine fractalkine/CX3CL1

Andrzejewski, Michael G.; Ludwig, Andreas

doi:29947

Requirements for cleavage and function of the transmembrane chemokine fractalkine/CX3CL1 = Voraussetzungen für die Spaltung und Funktion des transmembranen Chemokins Fraktalkin/CX3CL1

Andrzejewski, Michael G. (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michael Andrzejewski

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

UmfangIII, 110 S. Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Ludwig, Andreas (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-12-21

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-31142
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51388/files/Andrzejewski_Michael.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Pharmakologie und Toxikologie (528500-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Proteolyse (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Shedding (frei) ; Fraktalkin (frei) ; CX3CL1 (frei) ; ADAM10 (frei) ; fractalkine (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Leukozyten werden aus dem Blutstrom durch die Gefäßwand hin zum entzündeten Gewebe rekrutiert. Dieser Vorgang erfolgt in mehreren Schritten und wird zum Teil durch Chemokine reguliert. Innerhalb der großen Familie der Chemokine, die eine gerichtete Zellwanderung vermitteln, existiert ein ungewöhnliches Mitglied, das CX3CL1 (Fraktalkin), was als transmembranes und auch lösliches Molekül vorkommt. Dieses lösliche CX3CL1 Molekül wird im speziellen von der Metalloprotease ADAM10 durch limitierte Proteolyse (Shedding der Ektodomäne) gebildet. Durch die Bindung an den Rezeptor CX3CR1 vermittelt das transmembrane CX3CL1 außerdem Adhäsion und Transmigration von leukozytären Subpopulationen. Bis heute ist allerdings nicht klar, wie ADAM10 einen Beitrag zur Funktion des murines CX3CL1 leistet. Das Ziel dieser Arbeit war es nun, die molekularen Faktoren innerhalb des murinem CX3CL1, verantwortlich für die Spaltung und Funktion dieses Moleküls, zu charakterisieren. Ergebnisse dieser Studie haben mittels pharmakologischer Inhibition und transkriptionellen Silencing gezeigt, dass das murine CX3CL1 vorwiegend auch durch ADAM10 gespalten wird. Wie auch für das humane CX3CL1 beschrieben, wird das ADAM10 vermittelte Shedding von murinem CX3CL1 durch die Behandlung mit Ionomycin weiter verstärkt. Depletion und Ersatz der Spaltstellenregion von murinem CX3CL1 konnten die Freisetzung von löslichem CX3CL1 nicht weiter vermindern. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von murinem CX3CL1 auch durch die Chemokindomäne und den zytoplasmatischen Teil beeinflusst wird. Allerdings führte die Trunkierung dieses zytoplasmatischen Teils zu einer Beeinträchtigung der zellulären Verteilung des Moleküls. Jedoch wurden das wt CX3CL1 und die verkürzte Variante nach gleichwertiger Oberflächenexpression immer noch in gleichem Maße gespalten. Darüber hinaus ergaben Adhäsionsexperimente und Experimente zur Transmigration mit humanen PBMCs aber, dass diese Verkürzung die Funktion des murinen transmembranen CX3CL1 als Adhäsions- und Transmigrationsmolekül nicht beeinflusst. Somit spielen Ereignisse der Signaltransduktion, möglicherweise vermittelt durch den zytoplasmatischen Teil von CX3CL1, bei der Rekrutierung von Leukozyten zum entzündeten Gewebe keine Rolle. Diese Arbeit zeigt, dass mehrere molekulare Faktoren innerhalb des murinen CX3CL1 das eigene, über ADAM10 vermittelte, Shedding beeinflussen. Deshalb scheint es unmöglich mittels Austausch von verschiedensten Bereichen des murinen CX3CL1 das Shedding vollständig zu verhindern. Der zytoplasmatische Teil des murinem CX3CL1 scheint außerdem für die korrekte Verteilung des Moleküls, weder aber für das Shedding, die Adhäsion noch die Transmigration relevant zu sein. Dennoch ist es nicht ausgeschlossen, dass dem ADAM10 und ADAM17 vermitteltem Shedding von CX3CL1 eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten in kardiovaskulären Erkrankungen, wie der Artherosklerose, zukommt.

Leukocytes are recruited from the blood vessel wall towards the inflamed tissue. This process occurs in multiple steps and is regulated in part by chemokines. Among the large family of chemokines that mediate directional cell migration an unusual member the CX3CL1 (fractalkine) is described existing as a transmembrane and a soluble molecule. The generation of this soluble CX3CL1 molecule occurs upon ectodomain shedding by metalloproteinases, in particular by ADAM10. By binding to the receptor CX3CR1 the transmembrane CX3CL1 mediates adhesion and transmigration of leukocytes subpopulations. Up to date, it is not clear how ADAM10 contributes to the function of mouse CX3CL1. The goal of this thesis was to characterise the molecular determinants of mouse CX3CL1 for shedding and function of this molecule. Results of this study demonstrated that mouse CX3CL1 is predominately shed by ADAM10-dependent mechanisms as shown by pharmacological inhibition and transcriptional silencing. As described for human CX3CL1, shedding of mouse CX3CL1 is enhanced by ionomycin treatment, which also involves ADAM10-activity. Deletion and replacement of the cleavage region of mouse CX3CL1 could not further abrogate its release suggesting that other domains of mouse CX3CL1 may influence this process. And indeed, release of mouse CX3CL1 was found to be further influenced by the chemokine domain and also the cytoplasmic tail. However, truncation of the cytoplasmic tail led also to impaired cellular trafficking. In fact, when wt mouse CX3CL1 and the truncated variant were sufficiently expressed on the cell surface, both were still shed. Additionally, adhesion and transmigration experiments with human PBMCs revealed that the truncation did not affect the function of the transmembrane mouse CX3CL1 as an adhesion and a transmigration molecule. This latter finding suggests that potential signalling events induced by the cytoplasmic tail of CX3CL1 are not involved in the recruitment of leukocytes to the inflamed tissue. This work indicates that multiple molecular determinants within mouse CX3CL1 influence its shedding via ADAM10, suggesting that exchange of several domains of mouse CX3CL1 cannot completely prevent its shedding. The cytoplasmic tail of mouse CX3CL1 appears to be relevant for correct trafficking of mouse CX3CL1 but neither for shedding, adhesion or transmigration. Nevertheless, shedding of CX3CL1 by ADAM10 and ADAM17 could still represent a crucial step within the leukocyte recruitment process in developing vascular diseases such as atherosclerosis.

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