Influence of chemical and mechanical stress on precision-cut lung slices

Dassow, Constanze; Uhlig, Stefan

doi:3201

Influence of chemical and mechanical stress on precision-cut lung slices = Einfluss chemischer und mechanischer Noxen auf lebende Lungenschnitte (PCLS)

Dassow, Constanze

2010

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Constanze Dassow

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2010

UmfangVIII, 141 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Uhlig, Stefan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-03-18

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-32019
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51657/files/3201.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Pharmakologie und Toxikologie (528500-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Lunge (Genormte SW) ; Lungenverletzung (Genormte SW) ; Atemwege (Genormte SW) ; Künstliche Beatmung (Genormte SW) ; Bronchialasthma (Genormte SW) ; Dehnung (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; PCLS (frei) ; Alveolen (frei) ; Bronchokonstriktion (frei) ; lung stretch (frei) ; bronchoconstriction (frei) ; alveoli (frei) ; species differences (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Die Lunge ist durch ihre Lage und Funktion vielen Stressfaktoren ausgesetzt. Diese können in Form von chemischen Substanzen auftreten, oder zu einer direkten Verletzung des Lungengewebes führen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob und inwiefern sich präzisions-geschnittene Lungenschnitte (PCLS) als Stressmodell eignen. Ein Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Etablierung des Lungenschnitt-Modells aus Schafslungen und die Wirkung von Mediatoren auf die Atemwege und Blutgefäße. In vivo weisen Schafe sehr viele Merkmale des humanen Krankheitsbildes auf, deswegen wurde in dieser Arbeit das Modell der Schaf-PCLS etabliert. Während die Mediatoren Metacholin, Serotonin und Endothelin-1 zu einer starken Konstriktion der Atemwege in Schaf- PCLS führten, war die Reaktion auf Leukotriene und Thromboxane vergleichsweise schwach. Neben PCLS aus adulten Tieren wurden auch Lungenschnitte aus frühgeborenen Lämmern hergestellt und mit den adulten Schaf-PCLS verglichen. Atemwege aus frühgeborenen Schafen zeigten eine abgeschwächte Konstriktion im Vergleich mit denen aus adulten Tieren. Vergleicht man die Bronchokonstriktion der Schaf-PCLS mit den Literaturdaten humaner Lungenschnitte, so zeigt sich eine weniger gute Übereinstimmung der Daten als die in vivo beobachtete Übereinstimmung der Asthma-Charakteristika in Menschen und Schafen. Trotzdem bietet das Schaf-PCLS-Modell einige Vorteile gegenüber dem Nagermodell, zum Beispiel den Vergleich von Lungenschnitten aus adulten mit frühgeborenen Schafen. Weiterhin wurde die Bronchokonstriktion als Reaktion auf chemische Allergene in PCLS mit der Reaktion in vivo verglichen. Hierfür wurde ein bekanntes Maus-Sensibilisierungsprotokoll mit dem respiratorischen Allergen TMA, und dem dermalen Allergen DNCB als Modell genutzt. Die allergische Frühphase und die Atemwegshyperreagibilität wurden in vitro in Maus-präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten gemessen und mit in vivo Daten aus invasiven Experimenten verglichen. Durch die gute Übereinstimmung der Ergebnisse lassen sich PCLS als mögliche Alternative für in vivo Lungenfunktionsmessungen in Betracht ziehen. Stress-bedingte Bronchokonstriktion in PCLS durch chemische Allergene könnte als Vorhersage für in vivo Experimente dienen und damit für die Identifikation von chemischen Allergenen im Zuge der REACH (Regulation, Evaluation, Authorisation and restriction of CHemicals)-Richtlinien von Vorteil sein. Neben Stress durch chemische Substanzen kann die Lunge auch durch physische Stimuli in Form von Überdehnung des Gewebes Schaden nehmen, wie z. B. bei der künstlichen Beatmung. Zahlreiche in vivo- und Zellkultur-Modelle wurden entwickelt, um die Auswirkungen von mechanischem Stress auf das Lungenparenchym zu untersuchen. Obwohl durch diese Modelle schon viele wichtige Fragen beantwortet wurden, weisen sie immer noch einige Defizite auf. Während in vivo- Modelle oft zu komplex sind, um mechanische Eigenschaften adequat messen zu können, sind Zellkultur-Modelle oftmals zu einfach, um die Zusammenhänge der in vivo-Situation zu erfassen (beispielsweise verschiedene Zelltypen und die interstitielle Matrix). Deswegen haben wir ein neues Modell entwickelt, mit dem präzisions-geschnittene Lungenschnitte biaxial gedehnt werden können. Einzelne PCLS wurden auf einer dünnen, flexiblen Polydimethylsiloxan- Membran in den Bioreaktor eingespannt und durch Anlegen unterschiedlich hohen Druckes statisch ausgelenkt. Durch einen Genarray konnten wir weiterhin herausfinden, dass das Schneiden der Lunge an sich schon als physischer Stimulus wirkt und eine Anzahl von Genen hochreguliert. Bekannte Dehnungsmarker, wie zum Beispiel Amphiregulin, wurden durch den Schneideprozess hochreguliert. Bei dieser Induktion scheinen besonders Tyrosinkinasen und das Zytoskelett beteiligt zu sein, allerdings ließ sich die Hochregulation nicht vollständig blockieren. Daher war es uns nicht möglich, eine spezifisch durch Dehnung im Bioreaktor ausgelöste Amphiregulin-Induktion von der basalen Induktion abzugrenzen. Die Dehnung wurde mit Hilfe eines Finite-Element Modells untersucht. Dabei zeigte sich eine Dehnung von bis zu 38% in der Breite und bis zu 44% in der Längsrichtung. Diese Daten entsprechen Literaturdaten, die in intakten Lungen erhoben wurden. Die PCLS wurden außerdem dynamisch mit einer Frequenz von 0.25 Hz für 4 Stunden im Bioreaktor gedehnt, ohne die Zellstruktur zu verletzen. Die Anwendung von präzisions-geschnittenen Lungenschnitten als Modell für Stress in der Lunge hat sich als erfolgreich erwiesen. Verschiedene pathophysiologische Situationen der Lunge konnten in den Lungenschnitten untersucht werden. Speziesunterschiede stellen immer noch eine Problematik bei der Übertragung von Daten aus Tiermodellen auf die humane Situation dar. Daher eignen sich präzision-geschnittene Lungenschnitte besonders, die pulmonalen Reaktionen in verschiedenen Spezies zu untersuchen.

Lungs are exposed to different forms of stress such as chemical substances, allergens or in the form of direct tissue injury. This study examined whether precision-cut lung slices are suitable as a model for studying different types of stress. We established the use of PCLS from sheep to study the response of airways and vessels to mediators. According to in vivo experiments sheep are thought to represent the human pathophysiology better than rodents. We therefore established the use of sheep PCLS and showed that methacholine, serotonin and endothelin-1 lead to a bronchoconstriction, while the response to leukotriene and thromboxane was rather weak. PCLS were also produced from preterm sheep and compared to adult sheep, which revealed a decreased reagibility to methacholine and serotonin in preterm sheep. Comparison of the bronchoconstriction of sheep PCLS with bronchoconstriction data from human PCLS revealed a less satisfactory accordance than the one seen in vivo. Although sheep PCLS may not represent the characteristics of human PCLS completely, the results presented in this thesis indicate that they are closer to human PCLS than PCLS from rodents. Another kind of stress that we examined was chemical stress. This study also aimed at studying the usefulness of PCLS to study respiratory allergens as required in the REACH (Regulation, Evaluation, Authorisation and restriction of CHemicals) process. Bronchoconstriction in PCLS as response to chemical allergen was investigated and compared to bronchoconstriction in vivo. For this purpose a well established sensitisation protocol with TMA, a respiratory allergen and DNCB, a dermal allergen, was used. The early allergic response and airway hyperresponsiveness in mouse PCLS was investigated and compared to data from in vivo invasive measurements. Acquired measurements were comparable suggesting PCLS as a reasonable alternative to invasive lung function measurements. Hence, stress-related bronchoconstriction to chemical allergens may be a suitable predictability for in vivo experiments. Several in vivo and cell culture models have been developed to study the pulmonary responses to mechanical stretch. While providing extremely useful information, these models do also suffer from limitations in being either too complex for detailed mechanical or mechanistic studies, or being devoid of the full complexity present in vivo (e.g. different cell types and interstitial matrix). Therefore, we developed a new model, based on the biaxial stretching of precision-cut lung slices. Single PCLS were mounted on a thin and flexible carrier membrane of PDMS in a bioreactor and the membrane was stretched by applying varying pressures under static conditions. A gene array revealed a general upregulation of immune response and wound healing genes by the slicing process. Stretch markers like amphiregulin were upregulated in PCLS by the slicing process. This upregulation was dependent on tyrosin kinases and the cytoskeleton, but could not be blocked sufficiently, which made it complicated to differentiate a stretch response from the basal increase. Distension of the PCLS was modelled via finite element simulation. According to this analysis, lung tissue was stretched by up to 38% in the latitudinal and by up to 44% in the longitudinal direction resulting in alveolar distension similar to what has been described in intact lungs. Lung slices were stretched dynamically with a frequency of 0.25 Hz for 4h, without causing cell injury. This indicates that the distension of PCLS in the bioreactor may not be suitable to study gene expression but allow the calculation of deformation and occurring forces of the PCLS during the stretching process. PCLS are a suitable model for studying different forms of stress in the lung and allows the investigation of different pathophysiological situations. Additionally, PCLS may serve as a link between different species.

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