In vitro Expansion von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen durch Komponenten der Stammzellnische

Walenda, Thomas; Wagner, Wolfgang

doi:999910131174

In vitro Expansion von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen durch Komponenten der Stammzellnische = In vitro expansion of hematopoietic stem- and progenitor cells using components of the stem cell niche

Walenda, Thomas (Author)

2011 & 2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Thomas Walenda

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangVII,123 Bl. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011

Zsfassung in dt. und engl. Sprache. Prüfungsjahr: 2011. - Publikationsjahr: 2012

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Wagner, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-12-16

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-39177
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/52292/files/3917.pdf

Einrichtungen

Lehr- und Forschungsgebiet Stammzellbiologie (811002-3)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Hämatopoese (Genormte SW) ; Blutstammzelle (Genormte SW) ; Cytologie (Genormte SW) ; Zelldetermination (Genormte SW) ; Zelldifferenzierung (Genormte SW) ; Zellteilung (Genormte SW) ; Zelltransplantation (Genormte SW) ; Zellproteine (Genormte SW) ; Leukämie (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; hematopoietic stem cells (frei) ; mesenchymal stem cells (frei) ; stem cell niche (frei) ; in vitro expansion (frei) ; leukemia (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Blutstammzelltransplantationen könnten durch eine erfolgreiche in vitro Expansion von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen (HPC) auch mit kleinen Transplantaten zuverlässig durchgeführt werden. Bisher existieren keine zuverlässigen Protokolle, durch welche die Selbsterneuerung und Differenzierung von HPC in vitro kontrolliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde per Zellteilungs- und Immunphänotypanalysen demonstriert, dass durch Kokultivierung mit mesenchymalen Stromazellen (MSC) insbesondere die primitive HPC Subfraktion (CD34+ CD133+ CD38-) proliferiert und einen primitiven Immunphänotyp erhält, während die Zellen ohne Kokultur rasch ausreifen. Frühe MSC Passagen waren für die Kulturexpansion besonders geeignet. Mittels siRNA wurde die Expression von spezifischen Adhäsionsproteinen (N-Cadherin und VCAM1) und von Bindeproteinen an die extrazelluläre Matrix (CD44 und ITGB1) gezielt inhibiert, wodurch der Anteil an quieszenten HPC gesteigert bzw. ein primitiver Phänotyp erhalten werden konnte. Anschließend wurde systematisch die Auswirkung der Zugabe von 5 zuvor beschriebenen Zytokinen (SCF, TPO, FGF, ANGPTL5 und IGFBP2) in insgesamt 20 verschiedenen Kombinationen mit und ohne MSC-Kokultur auf Proliferation und Immunphänotyp von HPC untersucht. Zusatz von SCF, TPO und FGF konnte die Expansion von HPC sowohl mit als auch ohne MSC-Kokultur weiter steigern. Transplantationsexperimente an einem murinen Modell demonstrierten, dass die MSC-Kokultur die hämatopoetische Rekonstitution mit humanen Zellen erhöht. Daraufhin wurde untersucht, welche Faktoren die Regeneration der Hämatopoese nach Chemotherapie regulieren und kontrollieren. Serum von Patienten vor und nach autologer Stammzelltransplantation wurde gewonnen, jeweils 10% dem Kulturmedium zugesetzt und der Einfluss auf Proliferation und Immunphänotyp ko-/kultivierter HPC untersucht. Serum von 4 bis 11 Tagen nach Transplantation verstärkte signifikant die Proliferation, den Erhalt eines primitiven Immunphänotyps und das koloniebildende Potential. Dieser stimulatorische Effekt war kaum mehr nachweisbar mit Serum, welches über 14 Tage nach Chemotherapie gewonnen wurde. Mittels Chemokinarrays (174 verschiedene Chemokine) wurde nachgewiesen, dass 8 Chemokine (darunter 3 PDGF-Isoformen) während der hämatopoetischen Stimulation an Tag 8 erniedrigt sind, während das Monozyten Chemotaktische Protein (MCP1) erhöht war. Diese Ergebnisse belegen, dass eine Kokultur mit MSC die Proliferation der HPC steigert und gleichzeitig den Erhalt der Stammzellfunktion fördert. Dieser Effekt wird durch geeignete Chemokine weiter unterstützt. Darüber hinaus scheint die hämatopoetische Regeneration durch systemische Regulationsmechanismen kontrolliert zu werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen so zu einem besseren Verständnis der Regulationsmechanismen in der Stammzellnische bei.

A successful in vitro expansion of hematopoietic stem- and progenitor cells (HPC) is important for reliable cord blood stem cell transplantations with low cell numbers. For in vitro cultivation of HPC, there are no safe protocols existing which provide the ability to control self-renewal and differentiation. In this study, analyses of cell divisions and immunophenotype demonstrated that co-culture with mesenchymal stromal cells (MSC) especially stimulates proliferation of the primitive HPC subset (CD34+ CD133+ CD38-) and also maintenance of a more primitive immunophenotype. Without co-culture, the cells rapidly undergo maturation. In particular, early MSC passages were suitable for culture-expansion of HPC. The expression of specific adhesion proteins (N-Cadherine and VCAM1) and extracellular matrix binding-proteins (CD44 and ITGB1) was specifically inhibited by siRNA knockdown resulting in a higher proportion of quiescent HPC as well as maintenance of primitive immunophenotype. Subsequently, the effect of addition of 5 previously described cytokines (SCF, TPO, FGF, ANGPTL5 and IGFBP2) on proliferation and immunophenotype of HPC was analyzed in 20 different combinations with and without MSC-co-culture. Addition of SCF, TPO and FGF enhanced expansion of HPC without and with MSC-co-culture. Furthermore, transplantation experiments in a murine model showed an enhancement of hematopoietic reconstitution with co-cultured HPC. As a next step, factors were investigated that might regulate and control regeneration of hematopoiesis after chemotherapy. Serum was obtained from patients before and at different time points after autologous stem cell transplantation. 10% of serum was added to culture medium to test its influence on proliferation and immunophenotype of HPC cultured with and without MSC. Serum isolated 4 to 11 days after transplantation significantly enhanced proliferation, colony-stimulating activity and maintenance of primitive immunophenotype. This stimulating effect was hardly detectable with serum isolated more than 14 days after transplantation. Chemokine arrays were used to analyze the chemokine composition of serum samples. Among 174 chemokines, 8 (including 3 PDGF isoforms) were significantly down-regulated during hematopoietic stimulation on day 8, only concentration of monocyte-chemotactic protein 1 (MCP1) was increased. In conclusion, these results verify that co-culture with MSC enhances HPC-proliferation together with maintenance of stem cell function. This effect is further promoted by suitable chemokines. In addition, the hematopoietic reconstitution seems to be controlled through systemic mechanisms of regulation. Therefore, the results of this study further contribute to a better understanding of the regulative and controlling mechanisms in the hematopoietic stem cell niche.

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