Erfassung von mutagenen und rekombinogenen Effekten durch die Hefe 'Saccharomyces cerevisiae'

Neffgen, Anna; Klinner, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-20050208

Erfassung von mutagenen und rekombinogenen Effekten durch die Hefe 'Saccharomyces cerevisiae'

Neffgen, Anna (Author)

2005

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Anna Neffgen, geb. Kowol

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2005

UmfangIV, 135 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2004

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Klinner, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2004-12-16

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-20050208
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/59839/files/Neffgen_Anna.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Mutagenitätstest (Genormte SW) ; Rekombination (Genormte SW) ; Genetik (Genormte SW) ; Biotest (Genormte SW) ; Saccharomyces cerevisiae (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ziel dieser Arbeit war es, ein Testsystem zu konstruieren und zu validieren, mit dem mutagene und rekombinogene Effekte erfasst werden können. Das System umfasst zwei S. cerevisiae-Stämme. Bei dem haploiden Stamm HAN MAT-Locus alpha ura3(disruptiert) trp1(disruptiert) ADE2::URA3::kanMX4 wurde auf dem Chromosom XV distal zum ADE2-Locus das URA3-Gen und die kanMX4-Kassette inseriert. Der diploide Stamm DAN alpha/alpha ura3(disruptiert)/ura3(disruptiert) trp1(disruptiert)/trp1(disruptiert) PHO80/pho80::TRP1 ade2-101/ADE2::URA3::kanMX4 enthält auf Chromosom XV das gleiche Konstrukt wie der Stamm HAN. Darüber hinaus ist auf dem anderen Arm des Homologs von Chromosom XV centromernah das TRP1-Gen in den PHO80-Locus inseriert. Die beiden Stämme wurden durch Serien von gerichteten Mutationen und durch Protoplastenfusion konstruiert. Die Genotypen wurden durch molekulargenetische Methoden verifiziert. Die Verwendung der Antibiotikum-Resistenz und der counter-selektierbaren Marker URA3-ura3 und TRP1-trp1 ermöglicht die direkte quantitative Erfassung unterschiedlicher genetischer Ereignisse. Das URA3-Gen im Stamm HAN dient der Detektion von Vorwärtsmutationen. Durch die enge Kopplung des URA3-Gens mit dem ADE2-Locus und der kanMX4-Kassette können neben Punktmutationen auch großräumigere Sequenzänderungen wie Deletion, Insertion oder Inversion detektiert werden. Im diploiden Stamm DAN ermöglicht die Ermittlung der Gesamtzahl an Uracil-Auxotrophen die gleichzeitige Erfassung von Mutationen, mitotischen Genkonversionen, Crossover-Ereignissen sowie Chromosomenverlusten. Die Häufigkeit von mitotischen Rekombinationsereignissen wird durch die Berechnung der Differenz zwischen dieser Gesamtzahl und der Mutationsfrequenz im Stamm HAN ermittelt. Die Selektion auf Tryptophan-Auxotrophe ergänzt die Erfassung der Chromosomenverluste. Die enge Kopplung zwischen den ADE2-, URA3-, und kanMX4-Loci im Stamm DAN erlaubt eine phänotypische Differenzierung der Genkonversionen nach ihrer Länge in kurze (SGCs), mittel lange (MGCs) und lange (LGCs) Ereignisse. Durch die Homozygotie im Paarungstyp wird ausgeschlossen, dass meiotische Rekombinationsereignisse die Ergebnisse verfälschen. Die Häufigkeit spontaner Mutationen und Rekombinationsereignisse war bei dem Stamm-System etwa im erwarteten Bereich. Abweichungen betrafen das Auftreten von Genkonversionen und Crossover-Ereignissen im Stamm DAN. Sie kamen mit geringerer Frequenz vor als in einigen anderen Hefe-Testsystemen. Eine Ursache dafür kann in der homozygoten Konfiguration der Paarungstyp-Allele liegen. Die Validierung des Testsystems mit Substanzen mit bekannter Wirkung erbrachte die erwarteten Ergebnisse. MNNG und UV-Strahlung führten hauptsächlich zur Erhöhung der Mutationsfrequenz. Im geringeren Maße wurde das Vorkommen von Genkonversionen und Crossover-Ereignissen induziert. Eine Wirkung von Ethidiumbromid oder Benomyl konnte unter den gewählten Inkubationsbedingungen nicht nachgewiesen werden. Eine schwache mutagene und rekombinogene Wirkung von Anilin war zu beobachten. Bei dem HAN/DAN-System handelt es sich um ein Testsystem, mit dem mutagene und rekombinogene Einflüsse innerhalb weniger Tage erfasst werden können. Darüber hinaus können die genetischen Ereignisse durch phänotypische und molekularbiologische Methoden charakterisiert werden. Weitere Vorteile des hier entwickelten Testsystems liegen in der einfachen Handhabung und in der kostengünstigen sowie sensitiven Art potentielle Gefahrenstoffe zu identifizieren.

It was the aim of this work to design and validate a test system, which makes it possible to recognize mutagenic and recombinogenic effects. The system consists of two S. cerevisiae strains. In the haploid strain HAN alpha ura3(disrupted) trp1(disrupted) ADE2::URA3::kanMX4 the URA3 gene and the kanMX4 cassette were inserted on chromosome XV distal to the ADE2 locus. On chromosome XV the diploid strain DAN alpha/alpha ura3(disrupted)/ura3(disrupted) trp1(disrupted)/trp1(disrupted) PHO80/pho80::TRP1 ade2-101/ADE2::URA3::kanMX4 contains the same construction as the strain HAN. The TRP1 gene is inserted into the PHO80 locus, which is next to the centromere on the other arm of the homologue of chromosome XV. The two strains were designed by series of targeted mutations and by fusion of the protoplasts. The genotype was verified by molecular-genetic methods. The use of the antibiotic resistance and the counterselective markers URA3-ura3 and TRP1-trp1 makes the direct quantitative registration of different genetic events possible. With the help of the URA3 gene in the strain HAN forward mutations can be detected. The close coupling of the URA3 gene with the ADE2 locus and the kanMX4 cassette makes it possible to detect beside point mutations also more spacious sequence changes such as deletion, insertion or inversion. In the diploid strain DAN the determination of the total number of uracil auxotrophs allows the simultaneous registration of mutations, mitotic gene conversions, crossing over events as well as chromosome losses. The frequency of mitotic recombination events is determined by the calculation of the difference between this total number and the mutation frequency in the strain HAN. The selection of tryptophan auxotrophes supplements the assessment of the chromosome losses. The close coupling between the ADE2, URA3, and kanMX4 loci in the strain DAN allows a phenotypic differentiation of gene conversions according to their length, between short (SGCs), medium (MGCs) and long (LGCs) events. The homocygoticity of the mating type it prevents the falsification of the results by meiotic recombination events. Using the strain system, the frequency of spontaneous mutations and recombination events was as had been expected. Deviations concerned the frequency of gene conversions and crossing over events in the strain DAN. They occurred less frequently than in some other yeast test systems. A cause for this can be the homocygote configuration of the mating type alleles. Validating the test system with substances with well-known effect provided the expected results. MNNG and UV-radiation led mainly to the increase of the mutation frequency. To a smaller extent frequencies were induced by gene conversions and crossing over events. An effect caused by ethidiumbromide or benomyl could not be proven under the incubation conditions, which had been chosen. A weak mutagenic and recombinogenic effect of aniline was observed. The HAN/DAN system is a test system, with which mutagenic and recombinogenic influences can be recognized within few days. Beyond that the genetic events can be characterized by applying phenotypic and molecular-biological methods. Further advantages of the test system developed in this work are its easy handling and its reasonable price as well as the possibility to identify potential danger materials in a sensitive way.

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